01
研究背景
肝臟由四個葉組成，每個葉包含六邊形的小葉，複雜的血管結構在其中形成了營養和氧氣梯度。血液透過門靜脈進入小葉，並從中央靜脈排出，形成具有特化肝細胞群的不同代謝區。區域1含有圍門靜脈肝細胞，專門從事氧化代謝。區域3氧氣供應不足，包含圍中央肝細胞，這些細胞圍繞中央靜脈並特異性表達谷氨醯胺合成酶（GS），將穀氨酸轉化為谷氨醯胺。區域2位於區域1和3之間，包含具有中間代謝特徵的肝細胞。關於肝臟區域在再生中的作用存在爭議，一些報告建議區域3肝細胞具有幹細胞特性，參與再生，而其他人則認為區域2肝細胞主要負責再生。影響區域2肝細胞增殖的因素以及肝細胞區域與其他肝細胞型別之間的協調尚不清楚。
這篇論文探討了肝細胞再生的機制，特別是圍繞穀氨酸在這個過程中的作用。研究發現，肝細胞再生是一個精確協調的過程，涉及到肝細胞增殖以滿足身體的生理需求。肝臟的再生能力主要由肝細胞的增殖驅動，這一過程對於維持肝臟的穩態和在受到毒性損傷和壓力後有效恢復至關重要。理解這一過程的分子機制可能揭示肝臟疾病的治療靶點，增強肝臟切除後的恢復能力，併為患者擴充套件移植選擇。
02
研究發現
研究揭示了一種獨特的肝臟再生機制，涉及到一種非傳統的分子URI1，它在肝臟的周圍中心肝細胞中與谷氨醯胺合成酶（GS）共定位並激活GS。透過在小鼠中刪除GS或URI1基因，研究發現血液中的穀氨酸水平升高，從而加速了肝臟的再生。相反，過表達URI1會抑制肝臟的恢復，但透過補充穀氨酸或刪除GS基因可以逆轉這種抑制。穀氨酸透過代謝重程式設計骨髓來源的巨噬細胞，穩定HIF1α，從而轉錄啟用WNT3，促進YAP1依賴的肝細胞增殖，進而增強肝臟再生。
研究還表明，URI1透過調節GS來維持最佳的穀氨酸水平，以便根據機體的穩態和營養供應精確地調節肝臟的生長。在急性和慢性損傷模型中，包括穀氨酸水平低的肝硬化小鼠和肝切除術後早期死亡的小鼠，以及進行90%肝切除術的小鼠，補充穀氨酸可以增強肝細胞的增殖和存活。此外，URI1和GS在人體肝細胞中的表達與免疫細胞中的WNT3相關，這表明穀氨酸補充可能有助於肝臟再生，對等待移植或從肝切除術中恢復的患者有益。
03
臨床意義
穀氨酸的作用：研究發現，穀氨酸在肝臟再生中扮演關鍵角色。透過調節肝細胞中特定酶（谷氨醯胺合成酶）的活性，穀氨酸水平的變化可以顯著影響肝臟再生速度。這提示了穀氨酸或其代謝途徑成分可能成為促進肝臟再生的新型治療靶點。 URI1和GS的調控：研究表明，URI1蛋白透過與谷氨醯胺合成酶（GS）的相互作用調節穀氨酸水平。URI1的缺失或表達減少導致穀氨酸水平升高，從而加速肝臟再生。這表明URI1和GS的調控可能是維持肝臟再生和生長的關鍵機制。 巨噬細胞的代謝重程式設計：穀氨酸不僅直接影響肝細胞，還透過代謝重程式設計骨髓來源的巨噬細胞，穩定HIF1α的表達，進而啟用WNT3訊號通路，促進肝細胞增殖。這一發現為巨噬細胞在肝臟再生中的作用提供了新的視角，提示在再生過程中可能透過調控免疫細胞來增強治療效果。 臨床應用潛力：研究結果表明，穀氨酸補充可以在肝切除術後促進肝細胞增殖和存活，尤其是在急性和慢性肝損傷模型中，包括肝硬化小鼠和90%肝切除後。這意味著穀氨酸補充可能成為肝移植等待期或肝切除術後患者的輔助療法，幫助加速肝臟功能恢復。 人類疾病相關性：在人類肝臟疾病中，URI1和GS的表達與免疫細胞中的WNT3水平相關聯。這提示在肝臟疾病的不同階段，透過調控相關分子可以影響病情發展，進一步強調了這一機制在臨床中的潛在應用價值。 總之，這項研究揭示了肝臟再生中的一個關鍵分子途徑，強調了穀氨酸在促進肝細胞增殖中的重要性，併為肝臟疾病的治療提供了新的思路。未來的臨床研究可以基於這些發現，探索穀氨酸及其代謝調控在肝臟再生中的應用潛力。
04
實驗策略
1. 研究背景與假設： 研究假設是在肝臟再生過程中，區域3的肝細胞在影響區域2的增殖方面起作用。 透過單細胞RNA測序（scRNA-seq）和基因網路分析，識別區域3肝細胞特異的基因表達譜。
2. 關鍵分子與干預策略： URI1（Unconventional prefoldin RPB5 interactor 1）與谷氨醯胺合成酶（GS）在區域3的肝細胞中共定位並結合。 透過基因敲除和過表達實驗研究URI1和GS在肝臟再生中的作用。 透過抑制URI1來增加迴圈穀氨酸水平，加速肝臟再生。
3. 多模型驗證： 在急性和慢性損傷模型中（如肝硬化小鼠和部分肝切除後早期死亡模型）驗證穀氨酸的效果。 研究表明，在90%肝切除的小鼠中，穀氨酸補充可以增強肝細胞增殖和生存能力。
4. 人類相關性分析： 在人類肝臟組織中，URI1和GS的表達共定位，並且在不同的肝病階段與免疫細胞中的WNT3相關。 提示穀氨酸補充可能支援肝臟再生，對等待移植或從肝切除中恢復的患者有潛在的益處。
05
資料解讀
圖1：URI1在3區肝細胞中啟用谷氨醯胺合成酶（GS）
Figure 1 旨在探討URI1在肝臟區域化中的作用，特別是在3區肝細胞中對谷氨醯胺合成酶（GS）的啟用作用。 a. 為了分析小鼠肝臟3區肝細胞中與Glul相關的基因表達，作者利用scRNA-seq資料（GEO: GSE162713）繪製了熱圖，結果顯示了一些與Glul相關的基因表達模式。 b. 為了研究人類肝臟區域化中URI1的表達，作者分析了GEO: GSE115469資料，結果顯示URI1在不同肝臟區域中的表達差異顯著。 c,d. 透過免疫熒光共染色（co-IF）和定量分析，作者檢測了小鼠（c）和人類（d）健康肝臟中URI1+和GS+細胞的分佈，結果顯示在兩者中均存在URI1和GS的共表達。 e,f. 透過免疫共沉澱實驗，作者在小鼠肝臟（e）和HepG2細胞（f）中檢測了URI1和GS的相互作用，結果顯示兩者之間存在相互作用，短時間和長時間曝光均顯示了特異性結合。 g,h. 透過體外翻譯的HA-URI1與GST-GS的拉下實驗（g）或GST-URI1與HA-GS的拉下實驗（h），作者驗證了URI1與GS之間的直接相互作用。 i. 透過NMR分析，作者比較了Uri1(+/Δ)Hep和hURI1(+/KI)Hep肝臟與對照組的代謝物總量變化，結果顯示實驗組代謝物顯著增加。 j,k. 透過測定血漿穀氨酸水平，作者發現Uri1(+/+)Hep與Uri1(+/Δ)Hep小鼠（j）以及hURI1(+/+)Hep與hURI1(+/KI)Hep小鼠（k）之間存在顯著差異，實驗組穀氨酸水平顯著升高。 l. 透過體外GS活性實驗，作者使用GST-GS和不同濃度的體外翻譯HA-URI1，結果顯示URI1能夠增強GS的活性。 m,n. 透過體外GS活性實驗，作者使用免疫沉澱的GS從hURI1(+/+)Hep或hURI1(+/ΚΙ)Hep（m）和Uri1(+/+)Hep或Uri1(+/Δ)Hep肝臟（n）中提取，結果顯示在實驗組中GS活性顯著增強。 o. 透過體外GS活性實驗，作者使用從HepG2細胞中免疫沉澱的GS，結果顯示URI1顯著增強了GS的活性。 p. 透過免疫熒光共染色分析穀氨酸和E-cadherin（ECAD），並對Uri1(+/+)Hep、Uri1(+/Δ)Hep和hURI1(+/ΚΙ)Hep肝臟中的穀氨酸+細胞進行定量，結果顯示實驗組中谷氨酸+細胞顯著增加。 結論：URI1在小鼠和人類肝臟中透過與GS的相互作用，增強了GS的活性，特別是在3區肝細胞中，URI1的表達與穀氨酸水平和代謝物總量的增加相關。
圖2：URI1+肝細胞控制再生
Figure 2 探討了URI1在肝臟再生中的作用，特別是在部分肝切除術後的肝細胞再生過程中，URI1+肝細胞的功能。 A. 為了研究URI1在肝臟中的表達，作者對C57BL/6小鼠肝臟進行了URI1和谷氨醯胺合成酶（GS）的免疫熒光共染分析。結果顯示，在部分肝切除術後，URI1和GS的表達顯著增加。 B. 作者分析了肝切除術後不同時間和空間層次上Uri1和Glul的表達。結果表明，Uri1和Glul在肝臟不同層次的表達存在時空差異。 C. 透過核磁共振（NMR）分析，作者檢測了C57BL/6小鼠肝臟在肝切除術後的穀氨酸水平。結果顯示，術後1.5小時和48小時穀氨酸水平顯著變化。 D-G. 在肝切除術後7天，作者測量了肝臟與體重的比值，再生組織的比例，血漿白蛋白水平，以及透過Ki-67免疫組化（IHC）定量分析細胞增殖。結果顯示，URI1+肝細胞在肝臟再生中發揮了重要作用。 H-I. 作者生成了Uri1(+/Δ)Z3和Uri1(+/Δ)Z1小鼠模型，以研究URI1在肝臟再生中的具體功能。 J-L. 在肝切除術後7天，作者透過Ki-67免疫組化定量分析，測量肝臟與體重的比值，以及再生組織的比例。結果表明，URI1的表達影響肝臟再生的效率。 M-O. 在肝切除術後7天，作者透過Ki-67免疫組化定量分析，測量肝臟與體重的比值和再生組織的比例。結果進一步支援URI1在肝臟再生中的關鍵作用。 P-S. 在肝切除術後7天，作者透過Ki-67免疫組化定量分析，測量肝臟與體重的比值，再生組織的比例，以及血漿白蛋白水平。結果顯示，URI1+肝細胞在肝臟再生過程中具有重要的調控作用。 T-V. 在肝切除術後7天，作者透過Ki-67免疫組化定量分析，測量肝臟與體重的比值，以及再生組織的比例。結果進一步驗證了URI1在肝臟再生中的重要性。 結論：URI1+肝細胞在部分肝切除術後的肝臟再生過程中發揮了重要的調控作用，影響了肝臟的再生效率和功能恢復。
圖3：穀氨酸促進肝臟再生
Figure 3 研究了穀氨酸在肝臟再生過程中的作用，透過多種實驗方法評估肝臟再生的不同指標。 A. 為了評估手術後穀氨酸水平的變化，作者測量了手術後7天的血漿穀氨酸濃度。結果顯示，手術後血漿穀氨酸水平顯著升高。 B. 為了評估肝臟再生的程度，作者測量了手術後7天的肝臟與體重的比值。結果表明，手術後肝臟與體重的比值顯著增加。 C. 為了進一步評估肝臟再生，作者測量了再生組織的比例。結果顯示，再生組織比例顯著增加。 D. 為了評估細胞增殖，作者進行了Ki-67免疫組化定量分析。結果表明，Ki-67陽性細胞顯著增加，提示細胞增殖活躍。 E-H. 為了驗證假手術處理對肝臟再生的影響，作者測量了假手術處理後肝臟與體重的比值、再生組織比例和Ki-67免疫組化定量。結果顯示，假手術處理後這些指標沒有顯著變化，而肝切除術後這些指標顯著增加。 I-M. 為了評估不同處理對肝臟再生的影響，作者測量了假手術和肝切除術後肝臟與體重的比值、再生組織比例、Ki-67免疫組化定量和血漿穀氨酸水平。結果表明，肝切除術後這些指標顯著增加，而假手術處理後沒有顯著變化。 N-Q. 為了進一步驗證肝切除術後肝臟再生的變化，作者測量了術後48小時的Ki-67免疫組化定量、肝臟與體重的比值和再生組織比例。結果顯示，肝切除術後這些指標顯著增加。 R-T. 為了評估肝切除術後不同時間點的肝臟再生，作者測量了肝臟與體重的比值、再生組織比例和Ki-67免疫組化定量。結果表明，這些指標在肝切除術後顯著增加。 U. 為了分析巨噬細胞在肝臟再生中的作用，作者在單細胞RNA測序中檢測了髓系細胞群中的巨噬細胞標誌物。 V. 為了評估巨噬細胞的數量和亞群，作者測量了Uri1(+/Δ)Hep肝臟中的總巨噬細胞（F4/80+）和巨噬細胞亞群。結果顯示，巨噬細胞數量顯著增加。 W. 為了評估Uri1(+/Δ)Hep骨髓中的穀氨酸水平，作者進行了測量。結果表明，穀氨酸水平顯著升高。 X-Z. 為了評估骨髓移植後肝臟再生的變化，作者在hURI1(+/KI)Hep小鼠中進行了骨髓移植，並測量了肝臟與體重的比值、再生組織比例和Ki-67免疫組化定量。結果顯示，骨髓移植後這些指標顯著增加。 結論：穀氨酸透過促進細胞增殖和組織再生顯著增強了肝臟再生能力。
圖4：WNT3加速肝臟再生
Figure 4 主要關注穀氨酸對巨噬細胞的重程式設計作用，特別是透過HIF1α途徑的介導。研究提示，HIF1α和WNT3在穀氨酸促進的肝臟再生中起到了關鍵作用。 圖4a中，透過基因表達分析發現，在Glul(+/Δ)Hep小鼠中，由HIF1α調控的基因顯著上調，表明HIF1α可能在穀氨酸介導的肝臟再生中起到重要作用。 圖4b展示了骨髓來源巨噬細胞（BMDMs）的Hif1a基因表達狀況，顯示在Glul(+/Δ)Hep和Uri1(+/Δ)Hep小鼠中顯著上調。 圖4c進一步透過西 blot分析顯示，在Raw 264.7細胞中，穀氨酸在低氧條件下顯著上調了HIF1α的水平。 圖4d強調了EGCG抑制穀氨酸脫氫酶，間接抑制穀氨酸轉化為α-酮戊二酸從而穩定HIF1α的作用。 圖4e顯示了生成Hif1a(+/Δ)Myeloid小鼠模型的過程。最後，透過圖4m-t，研究表明WNT3的啟用可以恢復再生功能，特別是在Hif1a(+/Δ)Myeloid小鼠中，這展示了WNT3在促進肝臟再生中的關鍵作用。 綜上所述，Figure 4揭示了穀氨酸透過HIF1α穩定和WNT3表達來促進骨髓來源巨噬細胞的重程式設計，從而加速肝臟再生的機制。這提示了穀氨酸及其影響下的分子機制作為肝臟疾病治療潛在靶點的可能性。
圖5：肝臟再生需要YAP
Figure 5 主要探討了YAP1在肝臟再生中的作用。研究中的假設是，透過WNT3訊號傳遞，HIF1α+的骨髓來源巨噬細胞可能驅動肝細胞內YAP1的啟用，進而促進細胞增殖和肝臟的再生。 圖5a-e：透過Apc基因的敲除實驗，研究了β-catenin和YAP1在肝臟再生中的作用。Apc被敲除的小鼠顯示出比對照組更強的肝細胞增殖和再生能力。 圖5f-j：透過在Uri1(+/Δ)Hep小鼠中敲除Ctnnb1（編碼β-catenin的基因），研究結果表明β-catenin的缺失不影響肝臟再生，提示在此機制中YAP1可能比β-catenin更為重要。 圖5k顯示：對轉錄因子的過度表達分析表明在Uri1(+/Δ)Hep 小鼠中YAP1的顯著上調。 圖5l-n：進一步的基因表達分析顯示，與β-catenin無關，YAP1的靶向基因顯著上調，揭示YAP1訊號在再生過程中的核心地位。 圖5o-s：透過分析Uri1(+/Δ)Hep小鼠中的Yap1敲除，觀察到延遲的肝細胞增殖，證實了YAP1在肝臟再生中的必需性。 綜上所述，Figure 5的研究結果表明肝臟再生依賴於YAP1的活化，透過WNT3訊號途徑促進的這一本機制在缺乏β-catenin的情況下依然存在顯著效應，顯示了YAP1與肝細胞增殖和修復的關鍵聯絡。這一發現可能為未來針對肝臟損傷和再生的治療策略提供基礎。
06
主要結論
這篇研究揭示了一種新的肝臟再生機制，強調了非傳統的RPB5預摺疊蛋白相互作用體1（URI1）在肝細胞谷氨醯胺合成酶（GS）調控中的作用。研究發現，URI1透過與GS結合並激活它，維持了在肝臟再生過程中谷氨酸的最佳水平。這一機制在肝切除術後表現顯著，URI1或GS的基因耗竭會增加迴圈穀氨酸水平，加速肝臟再生。相反，URI1的過表達會抑制肝臟恢復，補充穀氨酸或耗竭GS可以逆轉這一效應。 穀氨酸透過代謝重程式設計骨髓來源的巨噬細胞，穩定HIF1α，從而轉錄啟用WNT3，促進YAP1依賴的肝細胞增殖，提升肝臟再生。研究表明，在急性和慢性肝損傷模型中，補充穀氨酸可以增強肝細胞的增殖和存活，尤其是在肝硬化小鼠中。研究還指出，URI1和GS在不同肝臟疾病階段與WNT3的表達相關，提示穀氨酸補充可能支援肝臟再生，對等待移植或恢復肝切除術的患者有益。
07
討論總結
研究強調了肝臟再生過程中不同肝細胞區域間的相互作用，特別是透過穀氨酸的旁分泌訊號傳遞。URI1作為肝細胞再生的調控因子，透過抑制GS活性來增加穀氨酸水平，啟用HIF1α+WNT3+的骨髓來源巨噬細胞亞群。分泌的WNT3促進肝細胞YAP1的核轉位，從而加速細胞增殖。研究還指出，穀氨酸可能透過影響單核細胞的遷移，而不是其發育，來促進肝臟再生。 總之，該研究提供了關於肝臟再生中谷氨酸在細胞間訊號傳導和巨噬細胞啟用過程中的關鍵作用的見解，建議穀氨酸補充或WNT3治療可能增強患者的肝臟再生能力。
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