肝臟健康的守護者！研究表明：肝星狀細胞調節肝細胞分割槽和再生，對酒精性和代謝性肝病有重要影響！

在《Nature》期刊發表的這篇文章中，美國哥倫比亞大學的研究團隊探討了肝星狀細胞（HSCs）在肝臟分割槽、大小和功能中的作用，特別是透過R-spondin 3（RSPO3）對WNT訊號通路的調節。研究發現，HSCs不僅在肝纖維化中扮演重要角色，還在不依賴纖維化的情況下，透過RSPO3調控肝細胞的基因表達、肝臟分割槽、再生能力和代謝功能。HSCs的去除會導致肝細胞WNT活性和分割槽的改變，從而顯著影響肝臟再生、細胞色素P450代謝和損傷。RSPO3的表達在HSCs活化時減少，並與酒精相關和代謝功能障礙相關的脂肪性肝病患者的預後呈負相關。這些發現揭示了HSCs透過RSPO3在健康和疾病狀態下對肝上皮細胞功能的保護和調節作用，提示在現有治療策略中應考慮整合這些功能。

研究背景

肝臟是機體內代謝和解毒的中心器官，具有顯著的再生能力以維持其功能。肝細胞在肝臟的不同區域中執行特定的代謝功能，這種區域化（zonation）由肝竇內皮細胞、膽管細胞和庫普弗細胞等多種細胞型別共同支援。肝星狀細胞（HSCs）在健康狀態下主要儲存視黃醇，而在肝損傷後則參與纖維化。然而，HSCs在肝臟微環境中的其他功能尚不清楚。以往研究中，HSCs的去除對肝臟再生和損傷的影響並不一致，直到最近的研究揭示了HSCs在維持肝細胞增殖中的作用。

本研究結合了HSCs的基因去除和候選基因的條件性敲除，分析了HSCs在不依賴纖維化的情況下對肝細胞的調控功能。研究發現，HSCs透過R-spondin 3（RSPO3）和WNT訊號通路調節肝細胞的基因表達、區域化、肝臟大小、再生能力及細胞色素P450介導的解毒功能。RSPO3的表達在HSCs活化時減少，並與酒精相關性和代謝功能障礙相關的脂肪肝疾病患者的預後呈負相關。這些發現表明，HSCs透過RSPO3在健康和疾病狀態下對肝上皮細胞功能的調控作用類似於其他器官中的R-spondin表達的基質小生境，這一機制應被納入當前的治療概念中。

研究發現

研究發現，HSCs的遺傳耗竭會改變肝細胞的WNT活性和分割槽，導致肝臟再生、細胞色素P450代謝和損傷的顯著變化。RSPO3被鑑定為HSCs富集的WNT訊號調節因子，負責這些對肝細胞的調節作用。HSCs中特異性刪除Rspo3會模擬HSCs耗竭對肝細胞基因表達、分割槽、肝臟大小、再生和細胞色素P450介導的解毒的影響，並加劇與酒精相關和代謝功能障礙相關的脂肪性肝病。RSPO3的表達在HSCs活化時減少，並與酒精相關和代謝功能障礙相關的脂肪性肝病患者的結果呈負相關。

研究表明HSCs透過RSPO3調節肝細胞的功能和分割槽。HSCs的耗竭導致肝細胞特徵性基因的減少，這些基因在代謝、再生和代謝功能障礙相關的脂肪性肝病和酒精相關肝病的發展中起作用。研究還發現，HSCs透過RSPO3調節肝臟的WNT活性，影響肝細胞增殖、代謝和分割槽。HSCs分泌的RSPO3透過其受體LGR4和LGR5與肝細胞相互作用，調節肝臟大小、分割槽和功能。研究揭示了HSCs在健康和疾病中透過RSPO3調控肝上皮細胞功能的機制，這與其他器官中R-spondin表達的基質生態位相似。

臨床意義

HSC缺失的影響：

在HSC缺失的情況下，肝臟再生能力顯著下降，表現為肝臟體積減少和肝細胞增殖標記物（如Ki-67和Cyclin D1）顯著降低。
HSC缺失的肝臟對不同型別毒物的反應不同：對APAP和CCl4等中心區毒物的損傷顯著減少，而對圍門脈毒物（如烯丙醇）的損傷增加。
RSPO3的作用：

RSPO3在HSC中表達，並透過調節WNT訊號通路影響肝細胞功能。HSC特異性刪除Rspo3導致肝臟分割槽改變和代謝功能受損，與HSC缺失的效應類似。
臨床相關性：

RSPO3在肝病進展中的表達動態變化，與肝硬化和脂肪性肝病的嚴重程度相關，提示其在肝病管理和治療中具有潛在應用價值。
綜上所述，本文揭示了HSCs透過RSPO3在肝臟健康和疾病中的重要調節作用，為肝病的病理機制研究和治療策略提供了新的視角。

實驗策略

1. HSCs的遺傳耗竭實驗：

透過Lrat-cre與Cre誘導的白喉毒素受體（iDTR）系統，研究人員特異性地耗竭小鼠體內的HSCs。
研究觀察到HSCs的耗竭顯著影響肝細胞的WNT訊號通路活性和分割槽，進而影響肝臟再生、代謝和損傷。

2. 作用機制的探索：

透過HSC選擇性地敲除Rspo3基因，研究人員發現其效應與HSC耗竭對肝細胞基因表達、分割槽、肝臟大小、再生及細胞色素P450介導的解毒作用相似。
使用單細胞RNA測序（scRNA-seq）以及空間轉錄組學技術，確認RSPO3在HSCs中的高表達，並且其表達水平在HSC啟用時下降。

3. 肝臟再生與損傷模型：

在70%部分肝切除（PHx）後，觀察到HSC耗竭小鼠的肝臟再生能力顯著下降。
在注射肝毒素（如CCl4或對乙醯氨基酚）的小鼠中，HSC耗竭組顯示出顯著降低的肝損傷程度。

4. 細胞培養與體外實驗：

利用原代小鼠肝細胞與HSCs的共培養實驗，研究人員驗證了HSCs分泌的可溶性因子對肝細胞增殖的直接影響。

資料解讀

圖1：肝星狀細胞（HSCs）調節肝臟再生和損傷

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圖2：肝星狀細胞（HSCs）調節肝臟的代謝分割槽以及區域特異性的損傷和增殖

Figure 2 研究了HSCs在肝臟代謝分割槽中的作用，以及它們對特定區域損傷和增殖的影響。

A. 為了研究HSCs耗竭對基因表達的影響，作者對iDTR × Lrat-cre和JEDI模型中的HSCs耗竭小鼠與對照組進行了RNA-seq分析，篩選出40個下調的基因，並排除了HSCs富集的基因。結果顯示，HSCs耗竭導致這些基因的表達顯著下調。

B. 為了驗證RNA-seq的結果，作者在iDTRWT和iDTRhet小鼠中透過qPCR對iDTR × Lrat-cre模型中的選定基因進行了確認，結果表明這些基因在iDTRhet小鼠中的表達顯著低於iDTRWT小鼠。

C. 為了檢測HSCs耗竭對肝臟代謝酶的影響，作者在iDTRWT和iDTRhet小鼠中進行了CYP2E1、CYP1A2和CYP2F2的免疫組化（IHC）分析和定量，結果顯示在白喉毒素處理7天后，iDTRhet小鼠中這些酶的表達顯著低於iDTRWT小鼠。

D. 為了分析HSCs耗竭對肝臟區域基因表達的影響，作者進行了多重IHC分析，結果顯示在iDTRWT和iDTRhet小鼠中，區域基因的表達顯著改變。

E. 為了進一步量化區域標記基因的表達，作者對IHC實驗中的區域1（Zo1）、區域2-3和嚴格的區域3標記進行了定量分析，結果顯示在iDTRWT和iDTRhet小鼠中，這些標記基因的表達存在顯著差異。

F. 為了研究HSCs耗竭對WNT訊號通路的影響，作者進行了100重空間轉錄組學分析，結果顯示在iDTRWT和iDTRhet小鼠中，WNT調節基因、WNT靶基因和細胞標記基因的分割槽模式和表達存在差異。

G. 為了研究HSCs耗竭對肝細胞增殖的影響，作者在70%部分肝切除術（PHx）和TCPOBOP處理後，對iDTRWT和iDTRhet小鼠中Ki-67陽性細胞進行了區域定量，結果顯示iDTRhet小鼠中增殖細胞的數量顯著低於iDTRWT小鼠。

H. 為了研究HSCs耗竭對肝臟損傷的影響，作者在APAP、CCl4或烯丙醇處理後，對iDTRWT和iDTRhet小鼠中的壞死進行了區域定量，結果顯示iDTRhet小鼠中壞死的程度顯著高於iDTRWT小鼠。

結論：HSCs在調節肝臟的代謝分割槽、特定區域的損傷和增殖中起重要作用。HSCs的耗竭會導致基因表達、代謝酶活性、WNT訊號通路和肝細胞增殖的顯著變化。

圖3：肝星狀細胞來源的RSPO3調控肝細胞基因表達和肝臟分割槽

Figure 3 研究了肝星狀細胞（HSC）來源的RSPO3在調控肝細胞基因表達和肝臟分割槽中的作用。

a. 為了研究CTNNB1調控的基因在HSC耗竭肝臟中的表達變化，作者進行了RNA-seq資料的基因集富集分析（GSEA），並展示了Ctnnb1ΔHep與Ctnnb1fl/fl肝臟中下調的前15個基因在HSC耗竭與對照肝臟中的表達熱圖。

b. 使用CellPhoneDB分析健康小鼠肝臟單細胞RNA測序（snRNA-seq）資料，展示了HSC與肝細胞之間的主要配體-受體相互作用。

c. 透過snRNA-seq分析了健康小鼠肝臟中Rspo3的表達，樣本量為2個肝臟。

d. 使用RNAscope技術分析了Rspo3與TdTom+ HSC在Lrat-cre × TdTom肝臟中的共定位，展示了兩次技術重複中的代表性影像。

e. 透過RSPO3酶聯免疫吸附實驗（ELISA）檢測了原代小鼠HSC、內皮細胞（ECs）、Kupffer細胞（KCs）和肝細胞上清液中的RSPO3，樣本量為每組3個。

f. 使用100重空間轉錄組學資料分析了小鼠肝臟區域中HSC的Rspo3表達。

g. 透過qPCR分析了Rspo3fl/fl和Rspo3ΔHSC小鼠HSC中的Rspo3 mRNA表達，以及肝臟-體重比，樣本量分別為4和8（7雄性，1雌性）。

h, i. 透過qPCR（h）和免疫組化（IHC）結合形態計量和區域特異性定量（i）分析了Rspo3fl/fl和Rspo3ΔHSC肝臟中的WNT靶基因，樣本量為8（7雄性，1雌性）。

j. 使用100重空間轉錄組學資料分析了小鼠肝臟區域中EC的Rspo3表達。

k. 分析了分離的EC中的Rspo3 mRNA（每組4個樣本），以及Rspo3fl/fl和Rspo3ΔEC小鼠的肝臟-體重比，樣本量分別為6和8。

l, m. 透過qPCR（l）和IHC結合形態計量和區域特異性定量（m）分析了Rspo3fl/fl和Rspo3ΔEC肝臟中的WNT靶基因，樣本量為6和8。

結論：HSC來源的RSPO3透過調控肝細胞基因表達和肝臟分割槽，影響肝臟的功能和結構。

圖4：HSC來源的RSPO3調控肝細胞損傷、肝臟再生和脂肪變性

Figure 4 探討了HSC（肝星狀細胞）來源的RSPO3在肝細胞損傷、肝臟再生和脂肪變性中的作用。

A. 為了研究RSPO3對肝臟再生的影響，作者對Rspo3fl/fl和Rspo3ΔHSC小鼠進行了70%部分肝切除術（PHx），並透過免疫組化檢測Ki-67和cyclin D1的表達。結果顯示，Rspo3ΔHSC小鼠的Ki-67和cyclin D1表達顯著低於Rspo3fl/fl小鼠，提示RSPO3缺失抑制了肝臟再生。

B-D. 為了評估RSPO3對肝細胞損傷的影響，作者分別使用對乙醯氨基酚（APAP）、四氯化碳（CCl4）和烯丙醇處理Rspo3fl/fl和Rspo3ΔHSC小鼠。透過檢測壞死麵積、ALT水平和存活率，結果顯示Rspo3ΔHSC小鼠在APAP、CCl4和烯丙醇處理後均表現出更大的壞死麵積和更高的ALT水平，且存活率降低，表明RSPO3缺失加重了肝細胞損傷。

E. 為了進一步分析RSPO3對肝細胞增殖和壞死的區域性影響，作者對Rspo3fl/fl和Rspo3ΔHSC小鼠在APAP、CCl4和烯丙醇模型中的Ki-67陽性細胞和壞死區域進行了定量分析。結果表明，RSPO3缺失導致肝細胞增殖減少和壞死區域增大。

F. 為了研究RSPO3對脂肪變性的影響，作者對Rspo3fl/fl和Rspo3ΔHSC小鼠進行了Lieber–DeCarli飲食處理，並透過油紅O染色、ALT和AST水平測定以及Aldh2 mRNA的qPCR分析進行評估。結果顯示，Rspo3ΔHSC小鼠的脂肪變性程度更高，ALT和AST水平升高，Aldh2 mRNA表達下調。

G. 為了進一步探討RSPO3在飲食誘導的肝損傷中的作用，作者對Rspo3fl/fl和Rspo3ΔHSC小鼠進行了CDAA-HFD飲食處理，並透過油紅O染色、ALT和AST水平測定以及腫瘤數量和大小的評估進行分析。結果表明，Rspo3ΔHSC小鼠表現出更嚴重的脂肪變性和更高的腫瘤發生率。

H. 為了分析RSPO3對肝臟脂質代謝的影響，作者使用DESI-MS成像技術檢測了Rspo3fl/fl和Rspo3ΔHSC小鼠中甘油三酯（TG 52:3）和磷脂醯膽鹼（PC 36:5）的分佈，並對TG 52:3、TG 52:4和TG 55:8進行定量分析。結果顯示，RSPO3缺失導致甘油三酯在肝臟周圍中心區域的積累增加。

結論：HSC來源的RSPO3在肝細胞損傷、肝臟再生和脂肪變性中發揮重要調控作用，其缺失會加重肝細胞損傷，抑制肝臟再生，並促進脂肪變性。

圖5：RSPO3在肝臟疾病中的動態調節

Figure 5 探討了RSPO3（R-spondin 3）在肝臟疾病中的動態調節。

動態表達和下調：

研究發現，RSPO3的表達在CCl4處理和高脂高果糖飲食誘導的肝纖維化模型中的活化肝星狀細胞（HSCs）中顯著下降。這種下降與疾病進展階段有關，表明在疾病發展過程中，RSPO3可能處於適應不良的調節狀態。
在纖維化迴歸時，即HSCs去活化的過程中，RSPO3的mRNA水平顯示出恢復，與Col1a1和Hgf mRNA水平的部分恢復相一致。這一點強調了RSPO3在肝臟疾病程序中的可逆性潛力。
調節因子：

透過體外實驗，研究顯示TGFβ（尤其是TGFβ2和TGFβ3）是RSPO3表達的主要抑制因子，而PDGF和IL-1β對RSPO3表達影響較小。這些發現表明，TGFβ在RSPO3的區域性表達梯度中起重要作用，特別是在HSC中從中心靜脈到門靜脈的梯度表達。
人類資料驗證：

在人類的單核RNA測序分析中，RSPO3同樣主要在HSCs和圍中央的內皮細胞中表達。隨著MASLD、酒精性肝硬化和酒精性肝炎纖維化進展，不論是跨多資料集的分析還是患者樣本分析，HSC中的RSPO3 mRNA均呈顯著下降趨勢。這一結果在多個患者佇列中得到驗證，並與WNT靶基因的表達密切相關。
臨床關聯：

RSPO3與肝功能基因（如CYP1A2和CYP2E1）之間的正相關進一步表明，RSPO3表達下降可能與某些肝功能的喪失有關。
分析還顯示，較高的RSPO3表達與更低的死亡率、肝癌發生率和肝臟相關事件相關，尤其是在MASLD和酒精相關性肝炎的患者中。這表明RSPO3可能在保護肝臟功能和預測患者較好預後中具有重要意義。
總之，Figure 5揭示了RSPO3在肝臟疾病進展與纖維化中的重要調控作用，並暗示其在肝臟病理生理學中的潛在臨床應用價值。

主要結論

這篇來自哥倫比亞大學的研究表明，肝星狀細胞（HSCs）不僅在肝纖維化中起關鍵作用，還透過R-spondin 3 (RSPO3)對肝臟的分割槽、代謝和再生具有調控功能。HSC的基因敲除會改變肝細胞的WNT訊號活性和分割槽，顯著影響肝臟的再生、細胞色素P450代謝和損傷。研究發現，RSPO3作為HSC豐富的WNT訊號調節因子，負責這些調節作用。HSC選擇性刪除Rspo3在肝細胞基因表達、分割槽、肝臟大小及功能上與HSC缺乏表現相似，並加重酒精和代謝功能障礙相關脂肪肝疾病。

討論總結

研究表明，HSC透過RSPO3與肝細胞之間的訊號傳遞調控肝臟的重要功能，包括代謝、再生和細胞死亡。這些功能與肝臟特定區域的WNT訊號密切相關。RSPO3的表達隨著HSC的啟用而減少，在酒精和代謝功能障礙相關脂肪肝疾病患者中與不良預後相關。該研究挑戰了傳統的"纖維中心"概念，指出HSC在健康和疾病狀態中透過RSPO3對肝臟功能具有保護作用。研究建議，HSC與肝細胞的這種通訊在肝臟功能的調控中扮演著重要角色，提示在治療中應考慮到HSC的雙重作用以同時抑制纖維化和恢復肝功能。