01
研究背景
肝細胞癌（HCC）是全球癌症相關死亡的第三大原因，術後複發率約為70%。目前的預後工具，如分期系統和分子生物標誌物，在準確預測HCC復發方面仍有改進空間，尤其是對於早期HCC。一個可能的原因是這些方法未能充分考慮腫瘤微環境（TME）內的空間異質性和相互作用。HCC的TME以顯著的空間異質性為特徵，不同腫瘤區域的免疫細胞組成各異。先天免疫系統的自然殺傷（NK）細胞已成為早期HCC潛在的預後指標。NK細胞的活性和浸潤增加，尤其是在腫瘤內，與改善的生存結果相關。然而，患者腫瘤內NK細胞的精確空間分佈及其對預後的潛在影響尚未得到廣泛表徵。此外，腫瘤內免疫細胞的空間分佈與轉移性復發有關，表明免疫細胞在腫瘤區域的定位可能影響HCC復發。儘管如此，目前的臨床策略主要依賴於腫瘤特徵的組織病理學分層，而不考慮腫瘤內免疫細胞表型的空間背景，這需要全切片影像分析和人工智慧驅動的空間分析。
為了應對這些侷限性並利用空間免疫分析的潛力，我們將空間轉錄組學、蛋白質組學和多重免疫組化（mIHC）資料與人工智慧驅動的分析相結合。這一方法使我們能夠描繪HCC組織中侵襲前沿（IF）和腫瘤中心（TC）NK細胞的空間分佈及其與術後復發的相關性。在這些發現的基礎上，我們開發並驗證了一種TIMES評分系統，以基於關鍵免疫標誌物的空間表達模式預測HCC復發風險。此外，我們透過體外和體內模型闡明瞭SPON2+ NK細胞在HCC進展和復發中的功能作用，為觀察到的預後模式提供了機制見解。透過利用全切片影像分析和人工智慧驅動的空間分析，我們在HCC患者風險分層方面超越了當前的臨床因素。TIMES評分系統代表了HCC預後準確性的一步進展，我們的功能研究揭示了HCC復發的免疫學基礎。
02
研究發現
研究團隊開發了一種名為TIMES的空間免疫評分系統，透過分析肝細胞癌（HCC）組織中五種生物標誌物（SPON2、ZFP36L2、ZFP36、VIM和HLA-DRB1）的空間表達模式來預測術後復發風險。TIMES評分系統在預測HCC復發風險方面優於現有的TNM和BCLC分期系統，特別是在早期HCC患者中表現出色。研究表明，TIMES評分系統的預測能力主要來自於這些生物標誌物的空間分佈，而非單個標誌物的表達水平。
透過多中心佇列的驗證，TIMES評分系統在231名患者中實現了82.2%的準確率和85.7%的特異性。此外，研究還揭示了SPON2在增強NK細胞浸潤和IFNγ分泌中的作用，這為TIMES的預測能力提供了免疫學基礎。TIMES作為一個公開可訪問的工具，可能在HCC早期治療決策中發揮作用。
03
臨床意義
1. 提高HCC復發風險預測能力：TIMES評分系統基於五種關鍵生物標誌物（SPON2、ZFP36L2、ZFP36、VIM和HLA-DRB1）的空間表達模式，利用機器學習技術進行風險分層。在231名患者的驗證中，該系統的預測準確率達到82.2%，特異性為85.7%，明顯優於現有的TNM和BCLC分期系統。這表明TIMES評分系統能夠更早、更準確地識別出高復發風險患者，從而最佳化臨床管理。
2. 指導個體化治療策略：TIMES評分系統可能用於指導術後輔助免疫治療的患者選擇。在一項初步試驗中，TIMES評分較高的患者對輔助抗PD1治療的反應更好，這提示該評分系統可能在預測免疫治療反應中具有潛力，雖然需要進一步的驗證。
3. 公共可訪問性工具的開發：研究團隊開發了一個線上工具，使臨床醫生可以透過上傳病理影像來生成TIMES評分和復發風險報告，這為該工具在臨床實踐中的應用奠定了基礎。
總的來說，這項研究提出了一個綜合空間免疫資訊的TIMES評分系統，不僅提高了HCC術後復發風險的預測準確性，還為個性化治療決策提供了潛在的工具。未來的研究應繼續驗證TIMES在更大規模人群中的適用性，並探索其在其他癌症型別中的應用潛力。
04
實驗策略
1. 空間異質性分析：研究人員透過空間轉錄組學、蛋白質組學和多重免疫組化技術結合人工智慧分析，研究了HCC組織中NK細胞在侵襲前沿（IF）和腫瘤中心（TC）的空間分佈與術後復發的關係。
2. 生物標誌物篩選與模型開發：利用極端梯度提升（XGBoost）模型和反方差加權技術，基於五種關鍵生物標誌物的空間表達模式開發TIMES評分系統，用於預測術後復發風險。
3. 功能驗證與模型驗證：透過小鼠體內模型（包括NK細胞特異性Spon2敲除小鼠），驗證SPON2在增強IFNγ分泌和NK細胞浸潤方面的功能，並且在多中心佇列中驗證TIMES模型的預測能力。
05
資料解讀
圖1：空間多組學分析揭示NK細胞分佈與肝細胞癌復發的關聯
Figure 1 透過空間多組學分析探討NK細胞分佈與肝細胞癌（HCC）復發之間的關係。研究設計包括空間分析、人工智慧分析、蛋白質組學驗證以及預測模型的建立和驗證。A. 研究設計。作者在AS、IF和TC區域進行空間分析（10x Visium和DSP），透過人工智慧分析識別出五個與復發相關的基因，並透過LC-MS/MS蛋白質組學驗證。隨後開發了TIMES評分系統用於預測HCC復發，並透過3D生物列印和動物實驗進行驗證。B. 透過蘇木精-伊紅染色（H&E）和空間聚類分析對復發（REC）和非復發（non-REC）HCC組織進行檢測。結果顯示，REC和non-REC組織在空間聚類上存在差異。C. 透過UMAP嵌入分析18個Visium樣本（6個REC患者，11個non-REC患者）的空間轉錄組測序資料，結果揭示了樣本間的基因表達差異。D. 基於白細胞基因的富集分析顯示，與non-REC患者相比，REC患者的IF和TC區域NK細胞顯著富集。未配對雙尾Welch’s t檢驗顯示，IF區域P值為4.3 × 10^-4，TC區域P值為9.2 × 10^-4。E. 透過多重免疫組化（mIHC）染色檢測CD3、CD16、CD56和CD57在non-REC和REC組織中的表達，結果顯示兩組間存在差異。F. 在IF區域，CD3−CD57+ NK細胞在non-REC（n = 31）和REC（n = 30）患者中的比例差異顯著。箱線圖顯示non-REC組的最小值為0.19，最大值為4.31，中位數為1.06；REC組的最小值為0.18，最大值為1.24，中位數為0.62。未配對雙尾Student’s t檢驗P值為8.0 × 10^-4。G. 透過無病生存（DFS）分析，按CD3−CD57+ NK細胞與DAPI+細胞計數的中位比率（0.9028）對HCC患者進行分層。NK高表達組（NKhigh）中non-REC患者為21例，REC患者為10例；NK低表達組（NKlow）中non-REC患者為10例，REC患者為20例。Log-rank檢驗P值為0.0066。H. DSP影像顯示來自8個HCC組織的64個感興趣區域（白色圓圈），用於進一步分析。I. 在CD57高表達的IF區域進行NK細胞活化和分化的基因集富集分析。單尾置換檢驗結果顯示統計顯著性。NES表示標準化富集分數。結論：透過空間多組學分析，研究揭示了NK細胞分佈與HCC復發之間的顯著關聯，提示NK細胞可能在HCC復發中發揮重要作用。
圖2：肝細胞癌復發預測的不同空間基因表達模式識別
Figure 2 為了預測肝細胞癌（HCC）的復發，研究人員透過空間轉錄組學分析識別了不同的基因表達模式。A. 為了識別與HCC復發相關的基因表達模式，作者進行了空間轉錄組學分析。首先，對NK細胞中18,677個基因進行了差異表達分析，識別出241個具有空間差異的基因，然後篩選出23個在NK細胞中相對於其他免疫細胞差異表達的基因，最後使用廣義線性模型測試這23個基因對HCC復發的預測價值。B. 透過分析AS、IF和TC中的基因表達模式，發現非復發（non-REC）和復發（REC）HCC之間存在顯著差異。圖中線條代表均值，陰影區域顯示數值範圍。C. 使用模型預測HCC復發的準確性，結果顯示均值±標準差，基於100個驗證資料集。D. 關鍵基因的空間表達分析透過箱線圖展示了轉錄本計數，包括最小值、最大值、中位數（中心線）以及第一和第三四分位數（箱體邊界）。須線延伸至不被視為離群值的最極端資料點（1.5倍四分位距）。線條連線不同區域的均值。使用雙側Wald檢驗並控制假髮現率（FDR）。E. 基於蛋白質的NK細胞富集分析顯示，AS、IF和TC區域的樣本中，非復發和復發患者之間存在顯著差異。樣本量為：AS（來自2名非復發患者的6個ROI與來自4名復發患者的5個ROI），IF（來自2名非復發患者的9個ROI與來自4名復發患者的21個ROI，P = 0.0013）和TC（來自2名非復發患者的6個ROI與來自4名復發患者的14個ROI，P = 0.038）。使用非配對雙尾Student’s t檢驗。F. 顯示了來自兩名非復發患者和四名復發患者的ROI的平均蛋白質丰度。結論：透過空間轉錄組學分析，識別出與HCC復發相關的不同基因表達模式，這些基因可以用於預測HCC的復發。
圖3：HCC復發風險分層的TIMES評分系統開發
Figure 3 為了更好地預測肝細胞癌（HCC）復發風險，研究者開發了TIMES評分系統，該系統結合了空間和生物標誌物資訊，透過機器學習進行整合。A. 為了展示非復發（non-REC）和復發（REC）HCC組織中的生物標誌物表達，研究者使用多重免疫組化（mIHC）技術進行分析。影像中顯示了細胞核染色（DAPI，藍色）和生物標誌物：CD57（紅色）、SPON2（綠色）、HLA-DR（青色）、ZFP36L2（黃色）、ZFP36（橙色）和VIM（品紅色）。B. TIMES評分的開發透過機器學習整合空間和生物標誌物資訊。模型預測以機率值（Pi）表示，最終的TIMES評分（0.03–0.95）以五邊形形式呈現。C. TIMES評分在復發（REC，n=72）和非復發（non-REC，n=91）HCC患者中的分佈。使用非配對雙尾Wilcoxon秩和檢驗（P = 3.13 × 10^−13）進行統計分析，顯示兩組之間的評分差異。D. 結合TIMES評分與TNM分期和BCLC分期的無病生存（DFS）分析。陰影區域對應95%置信區間，中心線表示中位數。使用Log-rank檢驗進行比較，結果顯示：TNM<ii–timslow與tnm<ii–timshigh（p =="" 3.0="" ×="" 10^−7），tnm≥ii–timslow與tnm≥ii–timshigh（p="2.0" 10^−8）；bclca–timslow與bclca–timshigh（p="0.01），BCLCB+C–TIMSlow與BCLCB+C–TIMShigh（P" 1.0="" 10^−12）。="" e.="" 判別分析中的變數重要性，值大於1的變數被認為具有貢獻（虛線表示變數重要性="1）。重要變數包括丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉移酶（AST）和動態增強動脈期（DEAP）。" f.="" times評分、17個因素（單變數cox迴歸中的顯著因素）、3因素腫瘤大小（腫瘤最大尺寸、面積和負擔）、2因素血管侵犯（微血管和大血管侵犯）、bclc和tnm模型的受試者工作特徵（roc）曲線和曲線下面積（auc）。="" 結論：times評分系統透過整合空間和生物標誌物資訊，能夠有效地預測hcc患者的復發風險，並在結合tnm和bclc分期時，顯著提高了無病生存分析的準確性。<="" span="">
圖4：SPON2+ NK細胞的活化特徵及其在肝癌腫瘤中心的遷移潛力以及與高丰度的IFNγ+CD8+ T細胞的緊密接觸
Figure 4 主要聚焦於探討SPON2+ NK細胞在腫瘤微環境中的功能，特別是在肝細胞癌（HCC）中。NK細胞的特徵：研究首先比較了SPON2+ NK細胞和SPON2- NK細胞在免疫相關標誌物上的表達。發現SPON2+ NK細胞顯示出更高水平的啟用標記物（如IFNγ和穿孔素），並且顯示較低水平的抑制性受體。這提示SPON2+ NK細胞更具活性和細胞毒性。遷移潛力：利用3D生物列印的腫瘤模型，研究展示了SPON2+ NK細胞在遷移能力上的增強。相比於SPON2- NK細胞，SPON2+ NK細胞在接觸到肝癌細胞（HepG2）的距離方面表現出更強的遷移能力。透過流式細胞術分析也顯示，SPON2過表達的NK92細胞在遷移和分泌IFNγ的能力上表現優越。SPON2+ NK細胞與CD8+ T細胞的相互作用：透過多重免疫熒光染色技術，證實SPON2+ NK細胞能夠與CD8+ T細胞緊密接觸，特別是在非複發性HCC中的腫瘤中心。這種空間關聯提示兩者可能在抗腫瘤免疫應答中發揮協同作用。此外，體外共培養實驗表明，直接接觸SPON2+ NK細胞能顯著增強CD8+ T細胞的抗腫瘤活性，且這種作用依賴於IFNγ訊號。總結：Figure 4的實驗結果表明，SPON2+ NK細胞在促進抗腫瘤免疫應答中扮演重要角色。它們不僅展示更強的遷移和啟用潛力，還有助於調動CD8+ T細胞的活化，從而增強整體的抗腫瘤免疫反應。這一發現為最佳化HCC的免疫治療提供了潛在的靶點和策略。
圖5：SPON2敲除對NK細胞功能的影響在肝細胞癌小鼠模型中的作用
Figure 5 展示了有關SPON2在NK細胞功能中的作用及其對腫瘤生長和肝細胞癌（HCC）復發影響的實驗結果。SPON2敲除對腫瘤生長的影響：實驗首先比較了野生型（WT）小鼠和SPON2基因敲除（Spon2−/−）小鼠在皮下HCC模型中的腫瘤生長特徵。結果顯示，Spon2−/− 小鼠的腫瘤明顯比WT小鼠的大，且增長速度更快，這表明SPON2的缺失會加速腫瘤的生長。免疫細胞浸潤和功能分析：流式細胞術分析顯示，Spon2−/− 小鼠的腫瘤中浸潤的免疫細胞數量減少，同時IFNγ表達陽性的NK細胞和CD8+ T細胞的比例也有所下降。這說明SPON2可能透過促進NK細胞和CD8+ T細胞的浸潤及其效應功能來抑制腫瘤。NK細胞特異性SPON2敲除模型：為了進一步確認SPON2在NK細胞中的具體作用，研究者構建了NK細胞特異性SPON2敲除模型。結果表明，特異性敲除NK細胞中的SPON2導致了與全身性敲除類似的腫瘤增長加速現象，進一步支援了SPON2在NK細胞中的重要性。人源化腫瘤模型和SPON2作用的驗證：在人源化腫瘤模型中，轉移有SPON2過表達和SPON2敲除的NK細胞的鼠群實驗表明，SPON2過表達的NK細胞顯著抑制了肝癌生長，而SPON2敲除的NK細胞則不易於抑制。這表明SPON2的高表達與增強的抗腫瘤活性相關。臨床樣本分析：以臨床樣本為基礎的質譜流式細胞術分析發現，長時間無病生存的患者，其腫瘤中心部位SPON2+ NK細胞的富集程度顯著高於復發患者的周邊浸潤部位。SPON2+ NK細胞的富集也與較高的總生存率和IFNγ+ NK細胞的富集正相關，進一步佐證了SPON2在臨床腫瘤免疫中的潛在作用。總結：Figure 5的研究結果全面地表明，SPON2透過增強NK細胞的浸潤和效應功能在抑制HCC生長和復發中起到了關鍵作用。這些發現為新型免疫治療策略的開發提供了理論基礎和潛在方向。
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主要結論
這項研究由中科大的科研團隊在《Nature》上發表，提出了一種名為TIMES（腫瘤免疫微環境空間評分系統）的新方法，用於預測肝細胞癌（HCC）術後的復發風險。TIMES基於五個生物標誌物（SPON2、ZFP36L2、ZFP36、VIM和HLA-DRB1）的空間表達模式，結合空間轉錄組學、蛋白質組學和多重免疫組化資料，透過人工智慧驅動的分析，顯著提高了HCC復發風險的預測能力。相比傳統的TNM和BCLC分期系統，TIMES在患者風險分層中顯示出更高的預測準確性，尤其是在早期HCC中。
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討論總結
這項研究強調了在預測HCC復發風險時，僅依賴生物標誌物的表達水平是不夠的，必須考慮其在腫瘤組織中的空間分佈。研究發現，SPON2等標誌物能夠增強NK細胞的浸潤和IFNγ的分泌，從而為TIMES提供預測能力的免疫學基礎。此外，TIMES不僅在多中心佇列中驗證了其有效性，還顯示其可以補充現有的臨床因素和分期系統。這一工具有潛力在未來的肝癌管理中提供個性化的治療方案，尤其是在早期階段的HCC中。然而，研究也指出TIMES目前僅用於研究目的，尚未經過臨床決策驗證。未來需要更大規模的前瞻性研究來評估其在不同HCC表現和治療環境中的適用性。如果TIMES能夠被進一步驗證，它可能在指導免疫治療策略和其他癌種的管理中也能發揮作用。
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