01
研究背景
首先，肝臟是人體內一個關鍵的代謝器官，負責多種重要的生物化學過程，如葡萄糖生成、糖原合成、尿素迴圈、脂質生成、膽汁酸合成、蛋白質生產和藥物代謝。這些功能的嚴重損害會導致肝功能衰竭，通常需要進行肝移植。近年來，隨著抗病毒治療的進步，肝功能衰竭的病因從病毒性肝炎轉向與現代生活方式相關的代謝性肝病，特別是代謝功能障礙相關的脂肪性肝病。這種疾病如果不加以治療，會進展為脂肪性肝炎、肝硬化和肝功能衰竭。然而，由於缺乏能夠真實再現肝臟代謝功能的人類肝細胞模型，預防代謝性肝病的成功率有限。
其次，體外分離的肝細胞在增殖能力上迅速下降，與其在體內的強大再生能力形成對比。現有的培養方法只能暫時維持初級人類肝細胞的功能性，但會影響其擴增能力。雖然一些研究嘗試透過不同的策略來克服這一限制，如使用小分子抑制劑促進肝細胞的擴增，但這些方法往往導致膽管化生，即功能性細胞被重新程式設計為增殖能力較強的細胞。這種現象被稱為“paligenosis”，使得在再生醫學、藥物發現和毒理學領域中使用人類肝細胞面臨重大挑戰。因此，開發一種能夠長期擴增且保持功能性的人類肝細胞培養系統至關重要。
02
研究發現
人類成年肝細胞類器官的長期擴增和功能保持：研究團隊透過啟用Wnt和STAT3訊號通路，實現了人類成年肝細胞類器官的長期自我更新。YAP訊號的啟用促進了肝細胞的增殖，但會導致其向膽管細胞譜系分化。相反，Oncostatin M透過啟用STAT3訊號，促進了肝細胞的增殖，同時抑制了膽管化生，保持了肝細胞的特性。研究表明，這種類器官在移植到小鼠體內後，能夠重建受體小鼠肝臟的代謝分割槽結構，並在去除特定培養因子後，形成具有膽小管網路的肝索樣結構，表現出與體內肝細胞相當的主要肝臟代謝功能。
類器官在基因編輯和疾病建模中的應用潛力：研究表明，這些肝細胞類器官可以進行基因編輯，從而為代謝性肝病的功能建模提供了可能性。新開發的培養系統為人類肝病的治療策略開發提供了一個有前景的途徑。透過最佳化的培養條件，研究團隊成功地在體外模擬了肝細胞的代謝功能，這標誌著功能性類器官醫學的新時代。
03
臨床意義
肝移植的替代方案：HHOs可能成為肝移植的替代方案，特別是在供體短缺或無法進行肝移植的情況下。 藥物篩選和毒性測試：HHOs展示的藥物代謝能力與體內肝細胞相似，使其成為藥物篩選和毒性測試的理想模型。這可以加速新藥的開發和安全性評估。 代謝性肝病的研究和治療開發：HHOs提供了一個真實反映人類肝臟代謝功能的平臺，有助於深入研究代謝性肝病的病理機制，並開發針對這些疾病的治療策略。 再生醫學的應用：由於HHOs能夠進行基因編輯，它們可用於研究遺傳性肝病並探索基因治療的可行性。 總之，該研究不僅為肝細胞的體外長時間培養提供了新的策略，還為肝臟相關疾病的基礎研究和臨床應用開闢了新的方向。
04
實驗策略
1. 訊號通路啟用與抑制： 透過啟用Wnt和STAT3訊號通路，實現人類成年肝細胞類器官的長期自我更新。 YAP啟用促進肝細胞增殖，但同時導致其向膽管導向分化。 透過抑制TGFβ訊號和使用Oncostatin M啟用STAT3，促進肝細胞增殖並抑制導管化生，從而保持肝細胞特性。
2. 類器官培養體系的最佳化： 在培養基中新增EGF、HGF、FGF-10、Wnt/R-spondin、TGFβ抑制劑（A83-01和Noggin）、IL-6和PKA啟用劑（Forskolin），支援小囊狀類器官的形成。 透過去除某些培養因子（如Noggin和forskolin），並補充激素（如生長激素、催乳素和皮質醇），促進肝細胞類器官的線索狀結構形成及膽小管網路的建立。
3. 體內移植實驗： 將類器官移植到經過藥物處理以去除肝細胞的小鼠體內，評估其在小鼠肝臟中的再生能力和代謝分割槽結構的重建。
4. 基因編輯與功能建模： 類器官易於進行基因編輯，從而用於代謝性肝病的功能建模。
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資料解讀
圖1：人類成人肝細胞類器官在特定因子下的擴增
Figure 1 展示了人類成人肝細胞類器官（HHOs）在特定培養條件下的擴增情況，包括使用不同因子如IL-6和OSM對類器官的影響。 A. 為了觀察PHH來源的類器官在擴增培養基（加IL-6）中的表達情況，作者進行了免疫熒光染色。結果顯示，HHOs表達白蛋白，而ICOs則顯示CK19和EpCAM的表達。此結果在三個供體中獲得一致性。 B. 為了研究HHOs在擴增培養基中新增OSM或IL-6後的擴增情況，作者透過傳代比率和基於ATP的細胞計數估算了細胞數量。每個點代表一次傳代事件，三個類器官系在初始3個月內大約每2周傳代一次，傳代比率為3-12倍，‘x’表示傳代失敗。供體分別為39歲、53歲和61歲。 C. 為了觀察OSM對單個PHH來源類器官生長的影響，作者拍攝了時間推移影像。相同的類器官在相同放大倍率下顯示。此結果在兩個供體中獲得一致性。 D. 為了研究OSM對HHOs基底極性的影響，作者進行了代表性明場和整體免疫染色，標記了CDH1（藍色）、ZO-1（紅色）、整合素β4（綠色）和細胞核（白色）。此結果在四個供體中獲得一致性。 E. 為了分析膽管細胞相關轉錄因子、YAP靶基因和TGFβ訊號相關基因的轉錄組，作者對PHHs、ICOs和HHOs在有無OSM和LATSi（TRULI，5 μM）條件下進行了分析。供體分別為11個月和16個月。 F. 為了觀察HHOs在±OSM和±LATSi（5 μM）培養14天后的情況，作者進行了Alb和CK19的免疫染色（左）。細胞核用Hoechst 33342標記。結果顯示，CK19+類器官僅在無OSM和有LATSi的條件下觀察到（右）。 結論：人類成人肝細胞類器官在特定因子如IL-6和OSM的影響下能夠有效擴增，並且不同因子組合對類器官的極性和表型有顯著影響。
圖2：小鼠肝臟用人類肝類器官（HHO）再生
Figure 2 展示了透過異種移植方法，將人類肝類器官（HHO）移植到小鼠肝臟中，觀察其在小鼠肝臟中的再生情況。 a. 為了研究HHO在小鼠肝臟中的再生能力，作者設計了異種移植實驗流程。TK-NOG小鼠在接受ValGCV處理以消融肝細胞後，被移植了HHO或人類原代肝細胞（PHH）。每週採集血液樣本，並在8周後收集肝臟樣本。 b. 透過蘇木精-伊紅染色（H&E）和STEM121染色，展示了HHO移植物的代表性影像。結果顯示，移植的小鼠和人類肝細胞之間有明顯的界限。類似結果在21個PHH移植物（來自五個供體）和104個HHO移植物（來自八個供體）中獲得。 c–h. 研究了PHH或HHO（來自兩個供體）在小鼠肝臟中的再生情況。透過測量血清中人類白蛋白（hALB）的濃度隨時間的變化來評估再生效果。不同的HHO傳代次數用不同顏色表示；‘x’表示小鼠死亡。STEM121染色顯示了PY53和PY30 HHO移植物。再生效率透過人類肝細胞面積相對於總肝臟面積的比例計算。每個點代表一隻小鼠。統計分析顯示，與對照組PHH相比，HHO組的再生效率顯著提高。 i. 對HHO移植物進行了hALB（紅色）、閉合蛋白（綠色）和人類MRP2（藍色）的染色。結果顯示，來自PHH（一個供體）和eHHO（三個供體）的資料具有相似的結果。 j. 在HHO移植物中對分割槽標記物進行染色，HAL（紅色；頂部）位於門靜脈附近，CYP2E1（紅色；底部）位於中央靜脈附近。細胞核用Hoechst 33342（白色）染色；移植細胞為STEM121+（綠色）。門靜脈和中央靜脈的腔用虛線標出（*表示門靜脈）。來自PHH（兩個供體）和eHHO（HAL為六個供體，CYP2E1為八個供體）的代表性資料顯示了相似的結果。 k,l. 分別顯示了在STEM121+區域內HAL+（k）或CYP2E1+（l）面積的比例。每個點代表一隻小鼠的一個切片；每種條件下來自兩到三隻小鼠的平均比例。使用Welch雙側t檢驗進行統計分析。 結論：HHO能夠在小鼠肝臟中有效再生，並表現出與人類肝細胞相似的功能特性。
圖3：建立具有代謝功能的dHHOs（分化後的人體肝細胞類器官）
Figure 3 展示了文章中的一項關鍵實驗，即分化後的人體肝細胞類器官（dHHO）建立及其代謝功能的評估。 形態變化： dHHOs從上皮樣結構轉變為肝細胞樣結構，顯示出成熟的形態特徵。 膽汁酸代謝： 實驗證明dHHOs可以合成膽汁酸，並在膽汁小管中運輸熒游標記的膽汁酸衍生物，表明其具有生理功能。 膽汁酸的合成和分泌： LC–MS/MS分析顯示，與體外培養的人體肝細胞相比，dHHOs產生更高濃度的膽汁酸。 甘油三酯生產： dHHOs能夠合成甘油三酯，並在存在微粒體甘油三酯傳輸蛋白抑制劑時被阻斷，驗證了其代謝活性。 結論： 這些成功的分化實驗及其結果表明，透過最佳化培養條件，dHHOs不僅展示了典型的膽汁酸代謝功能，還具備了潛在的藥物發現和毒理學研究的應用能力。這為將來利用類器官模型進行更深層次的人類肝臟代謝研究奠定了基礎。
圖4：建立門靜脈肝細胞類器官
Figure 4 展示了對分化後的人體肝細胞類器官（dHHOs）的功能評估，特別是在再現肝臟門靜脈區域特定功能方面的能力。 葡萄糖合成與糖異生： dHHOs在飢餓後展示了較高的葡萄糖生成能力，併成功追蹤到13C標記的葡萄糖合成路徑，證實了其有效的糖異生能力。 尿素合成： 使用15N標記氯化銨進行追蹤，發現dHHOs能夠轉變氨為尿素，驗證了其尿素迴圈的完整性。 線粒體功能活性： dHHOs顯示出高於eHHOs的最大呼吸能力，提示其具有更活躍的氧化磷酸化水平。 白蛋白和凝血因子生產： dHHOs能夠合成接近人體生理水平的白蛋白，並在維生素K存在下增加凝血因子的活性。 結論： 透過一系列功能性實驗，Figure 4展示了dHHOs在多種重要肝臟代謝功能方面的恢復能力，特別是與門靜脈區域相關的功能。這包括葡萄糖生成、尿素合成及相應代謝途徑的活躍性，表明dHHOs可以作為體外研究人類肝臟功能和代謝疾病的有效模型。
圖5：生成基因敲除的肝細胞類器官
Figure 5 展示了透過基因編輯技術生成基因敲除的人體肝細胞類器官（HHOs）的過程和結果。 基因敲除成功： 成功透過sgRNA實現了對G6PC和OTC基因的敲除，Sanger測序和免疫檢測確認了對應蛋白的缺失。 形態和功能保持： 儘管基因敲除，G6PC和OTC缺失的HHOs仍然保持了正常的類器官形態，並能夠合成一定水平的白蛋白。 功能影響： G6PC敲除使得糖異生功能降低，而OTC敲除導致瓜氨酸生成的缺失，驗證了各基因在其代謝途徑中的關鍵角色。 培養條件最佳化： 透過使用LATSi和人血小板裂解物，促進了基因編輯HHOs的擴增，而沒有引起生長停滯或管道分化。 結論： Figure 5描述了一種有效的流程來對成人肝細胞類器官進行基因敲除，從而提供一種穩定的模型來研究肝臟代謝疾病。這一進展為透過基因編輯技術探索肝臟功能、發現疾病機理和開發治療策略提供了可能性。
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主要結論
這項研究展示了一種新的培養系統，該系統能夠在體外長期擴增人類成體肝細胞類器官（HHOs），並保持其代謝功能。透過啟用Wnt和STAT3訊號通路，研究人員成功實現了HHOs的自我更新，並避免了導管化生的發生。HHOs能夠重新構建受體小鼠肝臟的代謝分割槽結構，並在體外展示出與體內肝細胞相當的主要肝臟代謝功能。這種文化系統為肝臟疾病的治療策略開發提供了新的途徑。
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討論總結
研究強調了HHOs技術在解決人類成體肝細胞體外擴增與功能性之間權衡的潛力。透過基因組學分析，關鍵的培養因子如EHF、Wnt/R-spondin、Noggin、TGFβ抑制劑、OSM和福司可林被確定為促進肝細胞擴增的必要因素。特別地，OSM-STAT3啟用不僅促進了肝細胞的增殖，還保留了肝臟譜系的完整性，防止了導管化生和上皮-間質轉化。 研究指出，HHOs技術代表了一種新的類器官培養系統，兼具肝細胞的擴增性和功能性。其優點包括提供了一個穩定、可重複且成本效益高的平臺，用於探索人類肝臟代謝，超越了傳統的人類肝細胞模型的侷限性。此外，HHOs在再生醫學中的潛在應用為解決肝衰竭問題打開了新的視野。
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