01
研究背景
結核病依然是全球範圍內由感染性疾病引起的主要死亡原因，2023年全球新發活動性結核病例約為1080萬，死亡人數達125萬。儘管已有多種治療方案，包括含貝達喹啉和普瑞託那米德的新型聯合療法，但耐藥結核的出現極大地挑戰了全球結核控制工作。此外，現有治療方案療程長、藥物副作用明顯，導致患者依從性差和治療失敗率高。因此，亟需開發更有效、療程更短且耐受性更好的結核治療方案，尤其是需要具有新穎作用機制的新藥物以應對耐藥問題。
在新型抗結核藥物研發中，靶向結核分枝桿菌的關鍵代謝通路成為研究重點，貝達喹啉靶向ATP合酶的成功即為典範。脫氧嘌呤生物合成途徑是結核分枝桿菌生理功能中不可或缺的代謝路徑，該途徑合成次黃嘌呤核苷酸（IMP），嘌呤作為核酸、能量分子及訊號分子的基礎組成部分，是極具吸引力的藥物靶點。該途徑的首個限速酶是PurF（醯胺磷酸核糖轉移酶），其催化從谷氨醯胺向磷酸核糖焦磷酸（PRPP）轉移氮原子的關鍵步驟。抑制PurF將阻斷嘌呤核苷酸的合成，進而影響結核分枝桿菌的生存和複製。然而，PurF此前尚未被探索作為結核藥物研發的靶點。本文報道了首個針對PurF的小分子抑制劑JNJ-6640的發現與驗證，展示了其在體外納摩爾級的殺菌活性及體內有效性，開闢了靶向脫氧嘌呤生物合成的新策略，為耐藥結核治療提供了潛在的新藥物候選。
02
研究發現
本研究首次發現並驗證了一種靶向結核分枝桿菌（M. tuberculosis）de novo嘌呤生物合成途徑中首個酶PurF的小分子抑制劑JNJ-6640。該化合物在體外表現出納摩爾級別的殺菌活性，且透過遺傳學和生化方法確認其高度選擇性地作用於PurF，阻斷了嘌呤核苷酸的合成，進而抑制細菌DNA複製和生長。體內外多種模型驗證了JNJ-6640的有效性，且人體和小鼠肺組織中嘌呤核苷酸的生理濃度不足以透過嘌呤救援途徑抵消PurF抑制，表明該靶點在體內具有重要的藥物開發潛力。此外，JNJ-6640可替代現有耐藥結核治療方案中的線唑胺，顯示出改善耐藥結核治療方案的潛力。
透過表型篩選和化學最佳化，發現併合成了JNJ-6640，具有極高的抗結核活性（MIC90約8.6 nM，MBC99.9約140 nM），且對臨床耐藥菌株無交叉耐藥。 抗藥性突變定位於PurF基因，結合分子對接和酶學實驗（PurF IC50約1 nM），確認JNJ-6640靶向PurF酶，且對人類同源酶PPAT選擇性高（IC50約14 μM）。 穩定同位素標記實驗顯示JNJ-6640顯著抑制細胞內de novo嘌呤合成，CRISPRi介導的purF基因敲低導致細菌生長受阻且對JNJ-6640敏感性增強。 血液和肺組織中嘌呤核苷酸濃度遠低於能救援PurF抑制的水平，表明體內嘌呤救援途徑不足以抵抗JNJ-6640作用。 單細胞顯微鏡觀察顯示JNJ-6640處理後細菌DNA複製停止，細胞生長受阻併發生細胞裂解，且該殺菌效應持續存在。 JNJ-6640在體內採用長效注射劑型（LAI）給藥，在急性和慢性感染小鼠模型中顯著降低肺內菌落形成單位（CFU）。 體外和體內聯合用藥實驗表明，JNJ-6640可替代線唑胺與貝達喹啉和普拉馬尼聯合使用，具有相似的抗菌效果，且與其他藥物的協同作用更佳。
03
臨床意義
【新靶點驗證】PurF作為M. tuberculosis嘌呤新生合成途徑的關鍵酶，其抑制可有效阻斷細菌DNA複製和生長，驗證了PurF作為抗結核新藥靶點的潛力。 【藥物選擇性強】JNJ-6640對人體同源酶抑制極弱，降低了潛在的宿主毒性風險，為臨床安全性提供初步保障。 【克服耐藥難題】JNJ-6640針對的PurF靶點與現有結核藥物不同，臨床耐藥菌株未表現交叉耐藥，有望成為治療耐藥結核的新利器。 【體內有效性】LAI緩釋劑型解決了短半衰期問題，實現持續有效藥物濃度，顯著減少菌載量，提示未來可開發長效用藥方案，改善患者依從性。 【適應多種生理狀態】JNJ-6640在低氧、細胞內等結核菌休眠狀態中仍具殺菌活性，顯示對難治菌群的潛在療效。 【最佳化聯合用藥方案】替代利奈唑胺，減少毒副作用風險，且與現有關鍵藥物貝達喹啉和普拉莫尼聯合顯示良好殺菌效果，為臨床耐藥結核短療程方案開發提供新思路。
04
實驗策略
1. 化合物篩選與活性測定： 使用384孔板進行劑量反應的MIC測定（測定90%和50%抑制濃度），以篩選抑制M. tuberculosis的化合物。 採用平板法及CFU計數，測定最小殺菌濃度（MBC99.9）。 透過誘導耐藥菌株及全基因組測序，識別耐藥相關突變點。
2. 靶點驗證： 透過CRISPRi系統精確調控purF基因表達水平，結合生長曲線分析確認PurF的必需性。 利用15N標記谷氨醯胺追蹤嘌呤代謝通路中氮的摻入，檢測化合物對代謝的抑制。 進行核苷酸/核苷鹼救援實驗，考察嘌呤回收途徑對PurF抑制的補償能力。
3. 蛋白表達與酶活測定： 在大腸桿菌中表達純化M. tuberculosis PurF蛋白，在昆蟲細胞中表達人類PPAT蛋白。 設計耦合酶活檢測法，監測PurF活性及其被JNJ-6640抑制的劑量依賴性。 評估選擇性及安全視窗。
4. 細胞及顯微鏡分析： 利用單細胞時序顯微鏡，觀察細菌在藥物作用下的形態及DNA複製動態（使用GFP-DnaN融合報告器）。 感染巨噬細胞體外模型，驗證藥物在細胞內的抗菌活性及對非複製狀態細菌的殺菌效果。
5. 體內藥效與藥代動力學： 採用BALB/c小鼠肺部感染模型，進行急性、慢性及高劑量感染測試。 採用長效注射劑型（LAI）解決JNJ-6640體內半衰期短的問題，實現持續藥物釋放與有效血藥濃度。 評估藥物耐受性及臨床化學指標變化。
05
資料解讀
圖1：JNJ-6640的發現
Figure 1 展示抗結核分枝桿菌（M. tuberculosis）活性化合物JNJ-6640的篩選和活性驗證過程。 A. 透過對先導化合物JNJ-7310系列的結構最佳化，作者獲得了系列主導化合物JNJ-6640。圖中展示了不同化合物對全細胞M. tuberculosis的最低抑菌濃度90%（MIC90）值，表明JNJ-6640在該系列中表現出優異的抗菌活性。圖中還區分了R和S兩種對映體，顯示了不同立體異構體的活性差異。 B. 採用劑量-反應曲線分析了JNJ-6640的殺菌活性，測定了其99.9%殺菌濃度（MBC99.9），結果為140 ± 63 nM。該實驗透過菌落形成單位（CFU）計數評估細菌存活，使用了4個生物學重複，資料以均值±標準差表示，檢測限（LoD）也被標註。 結論： JNJ-6640作為從JNJ-7310系列最佳化得到的主導化合物，表現出顯著的抗結核分枝桿菌活性，具有低納摩爾級的殺菌濃度，顯示出其作為潛在抗結核藥物的開發價值。
圖2：JNJ-6640靶點鑑定及風險評估
Figure 2 旨在鑑定JNJ-6640的靶點並評估其潛在風險，透過多種實驗手段驗證JNJ-6640作用機制及其對靶點的選擇性和細胞毒性。 A. JNJ-6640抗藥性克隆（R1-R5）的敏感性檢測。透過測定最小抑菌濃度90（MIC90），評估這些抗藥性克隆對JNJ-6640的耐藥程度，具體數值見擴充套件資料表2。 B. 採用誘導適應對接模型展示JNJ-6640（青色）在MtPurF結合口袋（灰色）中的結合模式。關鍵氨基酸Phe428（粉色）以及與藥物結合相關的相互作用和抗藥突變位點被標註，揭示了藥物與靶點的具體結合機制。 C. 透過15N穩定同位素摻入實驗，檢測在100 nM JNJ-6640處理後細胞內含氮代謝物的摻入比例。結果顯示對照代謝物谷氨醯胺是最豐富的含氮代謝物。實驗採用5個生物學重複，統計學採用雙側Bonferroni-Dunn校正的Welsh t檢驗。 D. 利用CRISPRi技術對purF基因轉錄進行不同程度（低、中、高）抑制，比較誘導劑ATc處理後各組的生長動力學。對照組為“空載體”，殺死對照為高表達atpE。實驗重複3次。 E. CRISPRi介導的PurF低水平敲低顯著增加細菌對JNJ-6640的敏感性。未誘導ATc時MIC50為6.4 nM，誘導後MIC50降至0.8 nM。技術重複3次，代表兩次獨立實驗結果。 F. 在CRISPRi介導的高、中、無（對照）purF轉錄敲低背景下，進行含10 µM核鹼基或核苷的救援實驗，分別在有（+ATc）和無（−ATc）誘導條件下進行。起始接種量約為1×10^5 CFU/ml。實驗重複3次。 G. JNJ-6640對MtPurF和人類同源酶PPAT的酶活性抑制實驗。JNJ-6640對MtPurF的IC50為1 nM，而對人類PPAT的IC50為14 µM。生物學重複2次。 H. 利用93種來源於不同組織型別的癌細胞系，檢測JNJ-6640及三種已知細胞增殖抑制劑（azathioprine，6-methyl-mercaptopurine riboside，mycophenolic acid）對細胞增殖的抑制作用。各組織型別的平均pIC50展示，pIC50約為4（對應IC50約100 µM）被視為無活性。代表兩次獨立實驗資料。 結論： JNJ-6640透過高親和力靶向MtPurF酶，抑制其活性，導致細菌生長受阻。CRISPRi敲低purF增強JNJ-6640敏感性，核鹼基補充可部分逆轉抑制效果。JNJ-6640對人類同源酶PPAT的抑制作用顯著較弱，提示較好的選擇性。細胞增殖實驗顯示JNJ-6640在多種癌細胞系中無明顯細胞毒性，降低了潛在的安全風險。
圖3：結核分枝桿菌單細胞水平下PurF抑制的分析
Figure 3 透過單細胞成像技術，動態觀察結核分枝桿菌在PurF抑制劑JNJ-6640處理下的生理變化及其恢復過程，揭示PurF抑制對細菌存活和DNA複製的影響。 3A. 實驗設計：使用表達熒光蛋白TdTomato的結核分枝桿菌，在微流控裝置中培養，連續312小時每小時拍攝一次影像。實驗期間（95-238小時）加入0.6 µM JNJ-6640抑制劑，隨後（239-311小時）洗去抑制劑並補充1×核苷酸混合物（NB mix）。結果顯示，代表性微菌落的熒光影像（TdTomato，洋紅色）呈現細菌群體的動態變化，尺度為3 µm。 3B. 實驗設計：基於單細胞成像資料，統計在0.6 µM JNJ-6640處理期間（灰色陰影）及洗去抑制劑並補充核苷酸混合物後（藍色陰影）細胞完整性的比例。共分析1195個細胞，覆蓋15個視野。結果顯示，抑制劑處理期間細胞完整性下降，洗去抑制劑並補充核苷酸後細胞完整性部分恢復。 3C. 實驗設計：使用表達DNA複製複合體標記蛋白GFP-DnaN的結核分枝桿菌（綠色通道），同時表達胞質TdTomato（洋紅色通道），拍攝抑制劑處理前、中、後的細胞影像。綠色焦點代表活躍的DNA複製複合體。結果顯示，抑制劑處理期間綠色焦點數量減少，表明DNA複製活性降低，洗去抑制劑後綠色焦點數量恢復。 3D. 實驗設計：統計在0.6 µM JNJ-6640處理期間（灰色陰影）及洗去抑制劑並補充核苷酸混合物後（藍色陰影）帶有GFP-DnaN焦點的細菌數量。資料來自8個獨立視野的時間序列，代表兩次獨立實驗。結果顯示，抑制劑處理期間帶有DNA複製複合體的細菌數量顯著減少，洗去抑制劑並補充核苷酸後數量部分恢復。 結論：PurF抑制劑JNJ-6640處理導致結核分枝桿菌細胞完整性下降和DNA複製活性顯著受抑制，洗去抑制劑並補充核苷酸後，細菌的細胞完整性和DNA複製活性均部分恢復，表明PurF活性對細菌存活和複製至關重要。
圖4：JNJ-6640活性轉化研究
Figure 4 旨在評估JNJ-6640在不同體外和體內結核病（TB）模型中的抗菌活性及其與現有藥物的聯合效果，進一步驗證JNJ-6640作為潛在抗結核藥物的應用價值。 A. 泡沫巨噬細胞實驗中JNJ-6640的敏感性檢測 實驗設計及結果：透過泡沫巨噬細胞實驗，比較了JNJ-6640在第4天單獨處理（濃度30 µM）與第4天加第5天處理（濃度0.66 µM）時的半數抑制濃度（IC50）。結果顯示，第4天加第5天處理組的IC50顯著降低，二者IC50比值達到45，表明JNJ-6640在泡沫巨噬細胞模型中具有較強的殺菌活性。實驗重複2次，每次含4個技術重複。 B. JNJ-6640在急性小鼠結核模型中的療效 實驗設計及結果：採用亞皮下注射方式給予JNJ-6640長效注射劑（LAI，劑量1500 mg/kg），分別以每兩週一次（1/14組，治療開始於感染後第7天）和每週一次（2/14組，治療開始於感染後第7天和第14天）給藥方案，21天后評估療效。結果顯示，JNJ-6640兩種給藥方案均顯著抑制急性感染小鼠體內結核菌負荷。對照組為每日口服25 mg/kg bedaquiline（BDQ）。每組5只動物，結果代表兩次獨立實驗。 C. JNJ-6640在慢性小鼠結核模型中的療效 實驗設計及結果：在慢性結核小鼠模型中，採用JNJ-6640 LAI（1500 mg/kg，亞皮下注射）每週一次給藥，連續8次（共56天），在感染後第84天評估菌負荷。結果顯示JNJ-6640顯著降低慢性感染小鼠的結核菌負荷。每組6只動物。 D. 體外聯合用藥實驗，JNJ-6640替代利奈唑胺 實驗設計及結果：在體外培養中，採用10 µM JNJ-6640替代6 µM利奈唑胺，與0.5 µM bedaquiline（B）、5.8 µM異煙肼和14.58 µM利福平（HR）、7 µM pretomanid（Pa）聯合使用，10天后檢測菌落形成情況。結果顯示，JNJ-6640替代利奈唑胺的聯合方案對結核菌的抑制效果與傳統方案相當。實驗包含3個生物學重複，代表兩次獨立實驗。虛線表示起始菌落數。 E. 體內聯合用藥實驗，JNJ-6640替代利奈唑胺在急性高負荷模型中的療效 實驗設計及結果：在急性結核小鼠模型中，採用JNJ-6640 LAI（1500 mg/kg，亞皮下注射，每週一次）替代利奈唑胺（100 mg/kg，口服，每日一次），聯合25 mg/kg bedaquiline、40 mg/kg pretomanid進行為期兩週的治療，治療開始於感染後第10天，24天后評估菌負荷。結果顯示，JNJ-6640替代利奈唑胺的聯合方案同樣顯著抑制結核菌生長。每組5-6只動物。 結論： JNJ-6640在泡沫巨噬細胞模型和急慢性結核小鼠模型中均表現出強效的抗結核活性。JNJ-6640能夠替代利奈唑胺與bedaquiline和pretomanid聯合使用，維持良好的抗菌效果，顯示出作為結核病治療新藥的潛力。
06
主要結論
發現並驗證了首個針對結核分枝桿菌（M. tuberculosis）de novo嘌呤生物合成途徑首個關鍵酶PurF（amidophosphoribosyltransferase）的新型小分子抑制劑JNJ-6640。該化合物在體外展現納摩爾級的殺菌活性（MIC90約8.6 nM），對PurF具有高度選擇性且不明顯影響人體同源酶PPAT，表明良好的安全視窗。 透過抗性突變篩選、基因敲低（CRISPRi）和生化酶活性測定等多重手段確認JNJ-6640的作用靶點為PurF，抑制其活性從而阻斷嘌呤核苷酸的de novo合成，導致DNA複製受阻，細菌生長停滯併發生細胞裂解。 體外穩定同位素標記實驗顯示，JNJ-6640顯著抑制嘌呤代謝；動物及人體肺組織中嘌呤核苷酸前體（核鹼基和核苷）的生理濃度遠低於能夠透過嘌呤拯救通路抵消PurF抑制的水平，證明體內生理條件下該靶點難以被旁路補償。 採用長效注射劑型（long-acting injectable，LAI）給藥，JNJ-6640在小鼠急性感染及慢性感染模型中均表現出顯著降低肺部菌落形成單位（CFU）的療效，驗證了該化合物的體內抗結核潛力。 JNJ-6640可替代現有耐藥結核治療方案中的線zolid，與bedaquiline和pretomanid等藥物聯用顯示良好協同，且與bedaquiline、pretomanid的配伍優於moxifloxacin，提示其有望成為耐藥結核的有效聯合用藥組合的一員。 目前JNJ-6640仍需最佳化其代謝穩定性以提升藥代動力學性質，但其作為PurF靶點的化學探針已為結核新藥研發開闢了全新方向。
07
討論總結
研究首次驗證了PurF作為結核分枝桿菌de novo嘌呤生物合成關鍵酶的藥物靶點，並證明針對該靶點的抑制劑JNJ-6640具備強效殺菌活性和良好選擇性，挑戰了以往對代謝通路靶點因潛在宿主毒性而持懷疑態度的觀點。 PurF靶點的驗證為抗結核藥物開發提供了新的生物學靶點，尤其適合開發新型作用機制的藥物，以應對當前耐藥結核治療面臨的挑戰。 JNJ-6640的發現依託於表型篩選結合藥物化學最佳化，充分體現了從化合物庫中發現並最佳化新型化學骨架的策略優勢。 該研究強調了使用多種體外和體內模型評估化合物療效的重要性，反映了結核病理的異質性及治療難度。 JNJ-6640在藥物組合中替代線zolid的潛力，尤其在減少毒性和應對耐藥性方面，具有重要臨床轉化價值。 長效注射劑型的應用不僅提高了JNJ-6640的體內暴露，也為未來結核治療方案中減少服藥頻次、改善患者依從性提供了技術路徑。 體內及人體肺組織中低濃度核鹼基水平表明，嘌呤拯救途徑不足以抵消PurF抑制，保障了該靶點抑制劑的體內活性。 未來工作需進一步最佳化化合物的藥代動力學性質，並探索結合其他嘌呤代謝靶點（如GuaB2）實現協同治療的可能性，推動PurF抑制劑進入臨床前和臨床研究階段。
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