01
研究背景
免疫檢查點阻斷（ICB）療法已成為多種實體瘤治療的革命性手段，但在卵巢透明細胞癌（OCCC）等腫瘤中療效有限，且缺乏有效的生物標誌物來預測治療反應。OCCC作為一種預後較差的卵巢癌亞型，其對單一PD-1/PD-L1抑制劑的響應率僅為5%至15%，現有的生物標誌物如PD-L1表達、腫瘤突變負荷、BRCA1/2突變及同源重組缺陷等均未能顯著預測ICB療效。儘管聯合阻斷PD-1/PD-L1和CTLA-4的免疫檢查點抑制劑顯示出較單藥更高的響應率，但OCCC患者的總體響應率仍較低，提示僅有部分患者能從ICB治療中獲益，亟需發現新的預測因子和治療策略。
本研究聚焦於OCCC患者中PPP2R1A基因的體細胞失活突變及其與ICB療效的關係。PPP2R1A編碼蛋白磷酸酶2A（PP2A）複合物的主要支架亞單位，突變多集中於功能關鍵位點，導致PP2A功能喪失。研究發現，攜帶PPP2R1A突變的OCCC患者在接受聯合CTLA-4和PD-1/PD-L1阻斷治療後，整體生存期和無進展生存期顯著延長。該發現不僅在多個癌種的獨立ICB治療佇列中得到驗證，還透過腫瘤活檢的轉化醫學分析揭示了這些突變腫瘤在治療前即表現出增強的干擾素γ訊號通路活性和三級淋巴結構的存在，治療後則顯示出更豐富的免疫浸潤和CD8記憶T細胞的擴增，提示PPP2R1A突變可能透過調節腫瘤免疫微環境促進免疫治療的有效性。
02
研究發現
本研究首次發現卵巢透明細胞癌（OCCC）患者腫瘤中PPP2R1A基因的失活突變與免疫檢查點阻斷（ICB）治療後的顯著生存獲益相關。攜帶PPP2R1A突變的患者表現出更長的總生存期（OS）和無進展生存期（PFS），這一發現不僅在OCCC佇列中得到驗證，還在多種癌症型別的ICB治療患者佇列中得到重複確認。機制分析顯示，PPP2R1A突變腫瘤在治療前即表現出增強的干擾素γ（IFNγ）訊號通路活性和三級淋巴結構（TLSs）的存在，ICB治療後腫瘤周圍CD8記憶T細胞（CD45RO+PD-1+CD8+）及自然殺傷（NK）細胞的浸潤和活化顯著增加，提示突變腫瘤具有更活躍的抗腫瘤免疫微環境。
進一步的體外和體內實驗表明，PPP2R1A基因的敲低或突變能增強腫瘤細胞對CAR-T細胞介導的殺傷敏感性，並在人源化患者來源異種移植（PDX）模型及免疫完整小鼠模型中顯著提高ICB治療效果。這些結果提示，PPP2R1A不僅可作為預測ICB療效的生物標誌物，其編碼的蛋白磷酸酶2A（PP2A）複合物的功能抑制也可能成為提升免疫治療效果的潛在治療策略。
03
臨床意義
PPP2R1A突變作為免疫治療的預測生物標誌物 研究中OCCC患者中攜帶PPP2R1A失活突變的患者，在接受雙免疫檢查點抑制劑聯合治療後，中位OS顯著延長（66.9個月 vs. 9.2個月）。 該生存優勢在多個獨立佇列及不同癌種中得到驗證，提示PPP2R1A突變具有廣泛的預測價值。 免疫微環境的積極重塑 PPP2R1A突變腫瘤基線即顯示增強的IFNγ訊號和TLS，TLS是已知與免疫治療反應良好相關的免疫結構。 免疫治療後，PPP2R1A突變組腫瘤浸潤的CD8+記憶T細胞和活化NK細胞顯著增加，提示免疫效應細胞活性和豐富度提升，促進抗腫瘤免疫反應。 延遲但持久的治療反應模式 臨床觀察到PPP2R1A突變患者常出現初期腫瘤負荷穩定或輕度進展後，繼而出現顯著的腫瘤縮小，提示該突變患者可能經歷“偽進展”，對免疫治療應給予足夠時間觀察療效。 潛在的治療靶點價值 PP2A複合體的核心亞單位由PPP2R1A編碼，其功能喪失透過多種機制（包括促進DNA損傷、增強抗原呈遞）啟用抗腫瘤免疫。 研究中PP2A抑制劑LB-100增強了免疫治療效果，相關臨床試驗已啟動，顯示出透過藥理學手段模擬PPP2R1A突變效應，提升免疫療效的可行性。 安全性與免疫相關不良事件 PPP2R1A突變患者接受ICB治療時，免疫相關3級及以上不良事件發生率較高，但這與免疫治療效益呈正相關，提示免疫啟用狀態加強。 其他癌種的推廣價值 在子宮內膜癌等PPP2R1A高突變率癌種中，該突變同樣與免疫治療（如lenvatinib+pembrolizumab）後的生存改善相關，提示其廣泛的臨床應用前景。該研究首次系統揭示了PPP2R1A失活突變與免疫檢查點抑制治療獲益之間的密切關聯，提示該基因突變可作為預測免疫治療反應的有效生物標誌物。更重要的是，PPP2R1A及其編碼的PP2A複合體成為潛在的免疫治療增效靶點，為未來免疫治療的個性化和組合治療策略提供了新的方向。臨床上，檢測PPP2R1A突變狀態有助於篩選可能獲益於ICB的患者，同時開發PP2A抑制劑與ICB聯用的治療方案，有望提升更多患者的治療效果。
04
實驗策略
1. 患者招募與臨床治療： 納入複發性鉑耐藥或難治性OCCC患者，確認並收集臨床資訊和腫瘤樣本，所有患者均簽署知情同意。 免疫治療方案包括tremelimumab（抗CTLA-4）和durvalumab（抗PD-L1）的聯合或序貫用藥，以及ipilimumab和nivolumab聯合治療。 採用RECIST v1.1修訂版（適用於免疫療法）評估腫瘤反應，允許治療延續至疾病進展。
2. 分子檢測與樣本採集： 採集治療前及治療中腫瘤活檢，製備福爾馬林固定石蠟包埋（FFPE）樣本。 利用臨床常規的NGS平臺完成腫瘤基因組測序，補充未測序病例採用研究用T200測序。 RNA提取後構建有鏈特異性mRNA文庫，使用Illumina NovaSeq 6000進行高通量測序。
3. RNA-seq資料分析： 質控（FastQC、RNA-SeQC）、比對（STAR 2-pass）、計數（HTSeq-count）。 差異表達分析（DESeq2）、基因集富集分析（GSEA）、免疫細胞組成估計（CIBERSORTx）。 TCR/BCR重建及多樣性計算（TRUST4，immunarch）。
4. 多重免疫熒光空間分析： 使用CODEX平臺，應用26抗體面板，對腫瘤樣本進行空間蛋白質組學染色。 利用QuPath軟體基於細胞核和標誌物共表達進行細胞分型及空間鄰域劃分。 統計分析免疫細胞密度及其在腫瘤與間質中的分佈，定義多細胞鄰域（中心細胞半徑80μm）。
5. 細胞系構建與基因編輯： 利用shRNA實現PPP2R1A基因敲減，利用慢病毒系統穩定表達野生型或突變型PPP2R1A。 應用CRISPR-Cas9介導的鹼基編輯技術（ABE和CBE）實現特定位點PPP2R1A突變的引入或修復。 構建過表達人CD19的細胞系，用於CAR-T細胞殺傷實驗。
6. 細胞毒性實驗： 採用B7H3或人CD19 CAR-T細胞共培養腫瘤細胞，評估活化的caspase-3表達、存活細胞計數及克隆形成能力。
7. 動物模型： PDX模型：將人子宮內膜癌樣本移植到人源化免疫小鼠Hu-BLT，隨機分組接受抗PD-L1或IgG對照治療。 同種移植模型：使用基因編輯的小鼠OCCC細胞接種免疫健全C57BL/6小鼠，接受抗PD-L1抗體治療。 監測腫瘤體積及體重，治療結束後稱重腫瘤。
8. 臨床佇列分析： 收集接受lenvatinib+pembrolizumab治療的高危子宮內膜癌患者，分析PPP2R1A突變狀態與生存結局的關聯。
05
資料解讀
圖1：PPP2R1A突變與卵巢透明細胞癌（OCCC）免疫檢查點阻斷（ICB）治療後更長生存期相關
Figure 1 展示了PPP2R1A基因突變與卵巢透明細胞癌患者接受免疫檢查點阻斷治療後生存期的關係，結合臨床試驗設計、患者療效和生存分析，揭示PPP2R1A突變可能作為預後生物標誌物。 A. 臨床試驗設計示意圖，展示了患者入組、樣本採集及後續分析流程。部分圖示由BioRender製作，明確了研究的整體框架和步驟。 B. 展示了入組患者的總體反應和結局。起始點為基線臨床評估時間，終點為患者死亡或資料截止時間。圖中顯示了患者在試驗期間的治療反應，包括完全緩解（CR）、部分緩解（PR）、疾病穩定（SD）和疾病進展（PD），並區分了PPP2R1A基因突變（mut）和野生型（WT）患者。 C. 基於PPP2R1A突變狀態的總體生存期（OS）Kaplan–Meier曲線分析。結果顯示攜帶PPP2R1A突變的患者生存期顯著延長，統計學採用單側log-rank檢驗。 D. 在PPP2R1A野生型患者亞組中，基於ARID1A突變狀態的總體生存期Kaplan–Meier分析。結果表明，在PPP2R1A野生型背景下，ARID1A突變與生存期無顯著相關性。 E. 在ARID1A突變患者亞組中，基於PPP2R1A突變狀態的總體生存期Kaplan–Meier分析。結果顯示，PPP2R1A突變仍與更長的生存期相關。 F. 代表性患者（患者0號）的CT掃描影像，展示治療過程中腫瘤負荷的變化。影像包括基線及治療後12、24和36周，箭頭標記了典型腫瘤病灶。患者經歷了初期病情進展，隨後出現腫瘤縮小響應。 G. 目標病灶反應的變化，以腫瘤直徑總和表示。終點為患者在試驗期間最後一次臨床評估時間。患者31號（標星）隨訪時間延長至基線後70.4個月，顯示長期療效。 H. 患者在試驗期間的最佳總體目標病灶反應，表現為腫瘤負荷相較基線的百分比變化。資料中超過100%的變化被截斷處理。 結論：PPP2R1A基因突變與卵巢透明細胞癌患者接受免疫檢查點阻斷治療後的更長生存期顯著相關，且這一關聯在不同ARID1A突變背景下均成立，提示PPP2R1A突變可能作為預測免疫治療療效的潛在生物標誌物。
圖2：PPP2R1A突變的卵巢透明細胞癌在基線及免疫檢查點抑制治療後表現出增強的免疫反應
Figure 2 旨在比較PPP2R1A突變組與野生型組卵巢透明細胞癌（OCCC）患者在免疫相關特徵上的差異，既包括治療前的基線狀態，也涵蓋免疫檢查點抑制（ICB）治療過程中的動態變化。 A-B. 透過基因集富集分析（GSEA）比較治療前（A）和治療中（B）OCCC樣本的免疫相關基因表達譜，結果顯示PPP2R1A突變組在多種免疫相關基因集上呈顯著上調，提示該組腫瘤具有更活躍的免疫微環境。分析中使用了假髮現率（FDR）和標準化富集評分（NES）進行統計驗證。 C-F. 利用配對樣本分析，比較PPP2R1A突變組與野生型組在治療前後CD8+ T細胞（C）、活化的自然殺傷（NK）細胞（D）、靜息狀態的NK細胞（E）以及總NK細胞數量（F）的相對丰度變化。結果顯示，PPP2R1A突變組在治療過程中CD8+ T細胞及活化NK細胞的丰度顯著增加，而野生型組變化不明顯，靜息NK細胞和總NK細胞的變化趨勢亦支援突變組免疫細胞活性的增強。統計學採用雙側Wilcoxon符號秩檢驗，箱線圖中中線代表中位數，箱體上下邊緣分別為第一和第三四分位數，鬚鬚表示1.5倍四分位距。 G-H. 分析治療前後T細胞受體（TCR）（G）和B細胞受體（BCR）（H）的多樣性（豐富度）變化，結果顯示PPP2R1A突變組的TCR和BCR豐富度在治療過程中顯著提升，表明該組患者免疫應答的多樣性和廣度增加，而野生型組無顯著變化。 結論：PPP2R1A突變的卵巢透明細胞癌患者在免疫檢查點抑制治療前後均表現出更為活躍和多樣化的免疫反應，具體表現為免疫相關基因表達上調、關鍵免疫細胞（CD8+ T細胞和活化NK細胞）丰度增加以及TCR和BCR多樣性提升，提示PPP2R1A突變可能促進腫瘤免疫微環境的啟用和免疫治療的響應。
圖3：帶有或不帶有PPP2R1A突變的卵巢透明細胞癌（OCCC）中的空間分辨免疫細胞景觀
Figure 3 透過CODEX多重免疫熒光技術，分析了帶有PPP2R1A基因突變與野生型的卵巢透明細胞癌（OCCC）患者腫瘤組織中免疫細胞的空間分佈和細胞群落特徵，旨在揭示PPP2R1A突變對腫瘤免疫微環境的影響。 A. 實驗設計：展示了用於CODEX檢測的抗體面板，涵蓋多種免疫細胞標誌物，用於識別不同免疫細胞亞群。該示意圖由BioRender繪製。 B-C. 實驗設計與結果：透過CODEX技術，比較了治療前樣本中增殖性B細胞（標記為CD20+Ki-67+，B）和生發中心B細胞（標記為CD20+CD21+Ki-67+，C）的細胞密度。結果顯示，攜帶PPP2R1A突變的患者樣本中，這兩類B細胞的密度顯著高於野生型患者，提示突變組腫瘤組織中B細胞活躍度更高。 D. 實驗設計與結果：展示了攜帶PPP2R1A突變患者（患者160）治療前樣本中腫瘤相關淋巴樣結構（TLS）的代表性CODEX影像。圖中可見明顯的TLS結構，尺度標尺分別為100μm（大圖）和200μm（小圖），表明突變患者腫瘤微環境中存在豐富的免疫細胞聚集。 E. 實驗設計：多細胞鄰域分析示意圖，說明了如何基於空間鄰近關係分析腫瘤細胞周圍免疫細胞的分佈。該圖由BioRender繪製。 F-G. 實驗設計與結果：統計分析了所有腫瘤細胞（F）及表達MHC-I腫瘤細胞（G）鄰域中兩類CD8+ T細胞的數量：（1）PD-1+CD8+ T細胞（CD45+CD3ε+CD8+CD4−PD-1+CD39+），（2）CD45RO+PD-1−CD8+ T細胞（CD45+CD3ε+CD8+CD4−CD45RO+GZMB+PD-1−CD39−）。結果顯示，在治療前和治療中，野生型PPP2R1A患者腫瘤細胞鄰域中這兩類CD8+ T細胞的數量均顯著高於突變組，尤其是在治療中差異更為明顯。細胞計數分別為：F中突變組治療前7,043，治療中12,758；野生型治療前17,346，治療中66,177。G中突變組治療前523，治療中1,532；野生型治療前212，治療中2,536。統計採用雙側Wilcoxon秩和檢驗。 H-I. 實驗設計與結果：展示了治療中樣本中腫瘤細胞鄰域內PD-1+CD8+ T細胞（H，患者157，PPP2R1A突變）和CD45RO+PD-1−CD8+ T細胞（I，患者137，野生型）的代表性CODEX影像，尺度標尺均為50μm。影像直觀反映了野生型患者腫瘤鄰域中CD8+ T細胞的豐富程度明顯高於突變患者。 結論： 帶有PPP2R1A突變的卵巢透明細胞癌患者腫瘤微環境中，增殖性B細胞和生發中心B細胞密度較高，且腫瘤相關淋巴樣結構更為豐富。然而，突變組腫瘤細胞鄰域內活躍的PD-1+CD8+ T細胞和CD45RO+PD-1−CD8+ T細胞數量顯著低於野生型組，提示PPP2R1A突變可能導致腫瘤免疫微環境中細胞免疫活性下降，影響抗腫瘤免疫反應。
圖4：PPP2R1A突變腫瘤對T細胞殺傷和免疫檢查點阻斷治療表現出更高敏感性
Figure 4 旨在探究PPP2R1A基因突變對腫瘤細胞被T細胞殺傷能力及免疫檢查點阻斷（ICB）治療敏感性的影響，採用基因編輯、CAR-T細胞共培養、患者來源異種移植（PDX）模型及同系小鼠卵巢透明細胞癌（OCCC）模型進行系統驗證。 A. 利用先前報道的全基因組CRISPR免疫篩選資料，比較T細胞處理組與對照組中針對PPP2R1A的嚮導RNA（gRNA）變化，結果顯示PPP2R1A相關gRNA在T細胞處理組中顯著減少，提示PPP2R1A缺失可能增強腫瘤細胞對T細胞的敏感性。 B. 透過檢測SKOV3細胞系中PPP2R1A基因敲低（shPPP2R1A）後暴露於B7H3 CAR-T細胞時活化的caspase-3表達，結果顯示PPP2R1A敲低組細胞中活化caspase-3水平顯著升高，表明PPP2R1A缺失增強了CAR-T細胞介導的細胞凋亡。 C. 採用PPP2R1A抑制劑LB100處理SKOV3細胞後，與B7H3 CAR-T細胞共培養，檢測活化caspase-3表達，結果顯示LB100處理組活化caspase-3表達顯著增加，支援PPP2R1A功能抑制能增強CAR-T細胞殺傷效果。 D. 過表達PPP2R1AP179R突變體的SKOV3細胞與CAR-T細胞共培養，結果顯示突變體組對CAR-T細胞介導的殺傷敏感性明顯提高，進一步驗證PPP2R1A突變增強腫瘤細胞對T細胞殺傷的易感性。 E-G. 在HEC50B和OVCAR429兩種細胞系中，分別構建野生型與CRISPR編輯的PPP2R1A突變細胞系，均過表達人CD19（hCD19），與hCD19 CAR-T細胞按不同效應細胞與靶細胞比例（E:T）共培養。透過克隆形成實驗（E）及細胞存活率測定（HEC50B (F)和OVCAR429 (G)），結果顯示PPP2R1A突變細胞系在各E:T比例下均表現出更低的存活率和克隆形成能力，表明突變細胞對CAR-T細胞殺傷更敏感。 H. PDX模型研究設計示意圖，採用人源化骨髓、肝臟和胸腺小鼠（Hu-BLT）移植人子宮內膜癌（Hu-EC）腫瘤，用於體內驗證PPP2R1A突變對免疫治療反應的影響。 I-J. PDX模型中，PPP2R1A突變腫瘤在治療結束時的形態（I）及腫瘤重量（J）測定，結果顯示突變組腫瘤體積明顯減小且重量顯著低於對照組，提示PPP2R1A突變增強了腫瘤對治療的敏感性。 K. 同系小鼠OCCC模型設計示意圖，分別構建Arid1a−/−Pik3caH1047R野生型和Ppp2r1aR183QArid1a−/−Pik3caH1047R突變型小鼠模型，用於評估PPP2R1A突變在免疫治療中的作用。 L-M. 在上述兩種同系小鼠模型中，治療期間腫瘤體積動態監測，結果顯示Ppp2r1aR183Q突變模型（M）腫瘤生長明顯受抑制，體積顯著小於野生型模型（L）。 N. 治療結束時兩組小鼠腫瘤重量測定，Ppp2r1aR183Q突變組腫瘤重量顯著低於野生型組，進一步證實PPP2R1A突變增強了腫瘤對免疫治療的響應。 結論： PPP2R1A基因突變或功能抑制顯著提高腫瘤細胞對T細胞殺傷的敏感性，增強CAR-T細胞介導的細胞凋亡，且在PDX及同系小鼠模型中表現出更佳的免疫檢查點阻斷治療效果，提示PPP2R1A突變可能作為免疫治療敏感性的潛在生物標誌物。
06
主要結論
PPP2R1A基因的功能缺失突變與卵巢透明細胞癌（OCCC）患者在接受癌症免疫檢查點抑制劑（ICB）治療後，顯示出顯著改善的總生存期（OS）。這樣的突變可能是ICB療效的預測生物標記。在其他癌症型別中，這種基因突變也可能與改善的治療結局相關。因此，PPP2R1A突變可作為識別對ICB治療響應良好的患者的潛在標誌物。研究還強調了PPP2R1A的抑制可能用於增強ICB的療效，提出了未來結合此基因的治療策略的新方向。
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討論總結
研究深入探討了PPP2R1A突變在癌症免疫治療中的重要性及其潛在的臨床應用。首先，他們發現PPP2R1A的功能缺失突變與改善的免疫檢查點抑制劑（ICB）療效密切相關。具體來說，這些突變在卵巢透明細胞癌（OCCC）患者中表現出顯著延長的總生存期，提示PPP2R1A突變可能成為ICB療效的有效預測生物標誌物。這一發現可能在個性化治療中具有重要意義，有助於識別那些可能從ICB治療中受益的患者，從而最佳化治療策略和醫療資源的分配。研究者強調，這種效應在接受標準化療的OCCC患者中並未觀察到，凸顯出 PPP2R1A突變在 ICB治療方面的獨特性。研究結果還表明PPP2R1A突變與增強的腫瘤微環境免疫活性相關，為進一步探索PPP2R1A抑制作為提高手術效果的新策略提供了基礎。研究者們建議對PPP2R1A突變的進一步驗證和機制研究，以更好地理解其在不同癌症型別上的廣泛影響，併為未來的臨床應用鋪平道路。此外，論文還探尋了PPP2R1A突變可能對其他癌症型別的治療產生的潛在影響。儘管研究主要集中在OCCC，但研究人員對更廣闊的癌症治療領域提出了假設。他們透過分析不同的癌症患者資料集，發現PPP2R1A突變在其他癌症型別中同樣與更好的ICB治療效果相關。這為研究者在其他癌症中探索PPP2R1A的生物標誌物功能提供了有力證據，並可能推動新的研究方向。在實驗室和動物模型中的研究也支援PPP2R1A突變可能透過增強免疫反應來提高ICB療效的假設。預臨床試驗顯示，PPP2R1A突變似乎增強了免疫系統對腫瘤的攻擊能力，進一步驗證了這一假設。這些發現為將PPP2R1A作為目標以提高ICB療效提供了基礎，同時也為開發新型組合治療方案以最佳化免疫療法的效果提供了思路。研究者們建議在不同的腫瘤模型和患者群體中進行進一步的研究，以全面驗證這些初步結果，從而在今後的臨床試驗中得以實踐應用。
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