01
研究背景
在抗擊細菌感染的過程中，抗菌藥物發揮了至關重要的作用。然而，即使在缺乏傳統抗藥性的情況下，臨床治療失敗的現象仍屢見不鮮。這種失敗往往被歸咎於宿主引發的細菌耐藥性，以及某些不易被殺滅的細菌亞群（如持久細胞）的存在。這些現象的確切影響似乎在實驗室條件下得到了支援，但在生理條件下的相關性尚不明確。在實驗室中，透過應激反應誘導的細菌耐藥性常被認為是抗菌藥物療效下降的原因之一。在此背景下，研究人員透過在小鼠模型中模擬複雜的人體感染環境，以及利用組織模擬性化學反應器來再現抗生素對侵襲性沙門氏菌感染的清除效果。該研究不僅關注沙門氏菌如何在不同的宿主應激條件下存活，還著眼於細菌異質性對抗菌療效的量化影響。這種以鼠模型為工具的研究方法，試圖橋接實驗室研究與臨床實際之間的鴻溝，力求揭示為何在患者中會觀察到抗菌治療不成功的情況。
更進一步地，沙門氏菌感染尤其具有挑戰性，由於其能夠在宿主體內形成異質細菌亞群，使得感染難以治療。這種異質性使得某些細菌亞群可能具備較強的生存能力，對標準抗菌療法的響應性較差。在感染的人和小鼠中，這種情況都得到了觀察，每年影響著約1500萬患者並導致約20萬例死亡。這些資料令人關注，促使研究者們深入探討在宿主環境下抗菌藥物清除細菌的限制因素。透過使用能表達綠色熒光蛋白（GFP）的沙門氏菌感染小鼠，研究者得以即時監控細菌的生長和抗菌藥物的效果。他們制定了一種標準化的治療劑量和給藥方案，並觀察到在感染的小鼠體內沙門氏菌的菌落形成單位（CFU）減少速度顯著低於實驗室條件下的標準敏感性測試。這一發現表明，在體內，宿主環境的多重應激狀態——包括酸性環境、營養匱乏等——對沙門氏菌的複製形成了抑制作用，從而降低了抗生素的清除效果。由此，研究進一步揭示了生理條件下影響抗菌藥物活性的複雜因素，使得抗菌藥物開發和應用中需要更加重視體內的營養匱乏狀態和其對細菌耐藥性的深遠影響。
02
研究發現
研究表明，儘管在實驗室條件下，沙門氏菌的壓力誘導耐藥性和持久細胞可以削弱抗菌活性，但在生理條件下的定量影響尚不明確。透過在感染小鼠和模擬組織的化學反應器中進行實驗，研究發現抗生素恩諾沙星和頭孢曲松在這兩種條件下對沙門氏菌的活性較差，主要是由於嚴重的營養飢餓限制了沙門氏菌的複製。其他與感染相關的條件，如酸性pH值、葡萄糖、氧化應激、硝化應激、抗菌肽、滲透壓、氧氣限制、二氧化碳和碳酸鹽，以及藥物外排、毒素-抗毒素模組和細胞大小對抗生素活性的影響有限。研究還發現，沙門氏菌的廣泛生存減少了超耐藥持久細胞的影響。透過更準確的單細胞即時檢測，顯示出沙門氏菌群體中普遍的高耐藥性，表明營養飢餓誘導的普遍耐藥性是抗生素清除效果不佳的主要原因。這些發現強調了在生理條件下使用即時單細胞檢測來量化抗生素活性的必要性。
研究總結了沙門氏菌在抗生素作用下的生存情況，發現抗生素恩諾沙星和頭孢曲松在感染小鼠和模擬組織的化學反應器中對沙門氏菌的殺菌效果較差。研究表明，沙門氏菌在營養匱乏的條件下表現出較高的耐藥性，導致抗生素清除效果不佳。此外，研究發現沙門氏菌的DNA損傷和生存能力在抗生素暴露後繼續受到影響，強調了營養飢餓在抗生素殺菌過程中的關鍵作用。透過單細胞即時檢測，研究揭示了沙門氏菌在抗生素作用下的損傷是緩慢且單相的，表明整個沙門氏菌群體對抗生素損傷具有較高的耐受性，而不是僅僅存在一個小的持久細胞亞群。
03
臨床意義
1. 抗生素清除效率低下的原因：研究表明，營養匱乏導致的沙門氏菌複製限制是抗生素清除效率低下的主要原因。這提示在治療難治性感染時，考慮組織內的營養狀況可能比僅關注細菌耐藥性更為重要。
2. 抗生素耐藥性與耐受性：在臨床實踐中，治療失敗常被歸咎於細菌的耐藥性。然而，該研究提出，即使在沒有耐藥性的情況下，細菌的生長環境也可能導致治療失敗。這意味著，在評估抗生素治療效果時，需綜合考慮細菌生理狀態和環境因素。
3. 治療策略的啟示：該研究強調了開發新型抗生素或治療策略時需要模擬營養匱乏的生理條件。這可能涉及到新藥開發中對細菌在低營養環境下的生長和存活特性的研究。
4. 單細胞即時檢測的重要性：研究指出傳統的CFU（菌落形成單位）測定可能低估了細菌的實際生存情況，建議使用單細胞即時檢測以獲得更準確的抗生素活性評估。這對於最佳化臨床抗生素使用和提高治療成功率具有重要意義。
總之，這項研究對理解沙門氏菌感染的治療挑戰提供了新的視角，指出在臨床治療中需關注細菌生存的生理環境，並可能需要調整治療策略以應對營養匱乏導致的治療困難。
04
實驗策略
1. 感染模型：使用易感小鼠感染表達綠色熒光蛋白（GFP）的沙門氏菌。在出現臨床症狀後，給予推薦劑量的恩諾沙星或頭孢曲松進行抗生素治療，並在不同時間點（如1小時、4小時）取樣分析。
2. 化學恆化器實驗：模擬小鼠脾臟的組織微環境，設定氧氣濃度、二氧化碳濃度、pH值及營養條件，來研究不同條件對抗生素殺菌效果的影響。
3. 單細胞即時評估：使用帶有DNA損傷感測器的沙門氏菌，透過顯微鏡觀察RecA聚集體的形成，即時檢測DNA雙鏈斷裂（DSBs）以評估抗生素對細菌的實際損傷。
4. 基因突變體分析：透過對突變體（如lexA3、tisB、Δ3T等）的抗生素作用效果進行評估，以確定DNA修復和毒素-抗毒素模組在抗生素耐受中的作用。
5. 營養供給的影響：在不同的營養條件下（如低密度批次培養和恆化器內的營養匱乏條件），研究沙門氏菌的複製速率對抗生素殺菌效率的影響。6. CFU測定與單細胞成像比較：透過CFU測定與單細胞成像結果的對比，發現傳統CFU測定可能低估了抗生素暴露期間的細胞存活情況，因為許多細菌在暴露後仍能透過修復DNA損傷繼續生長。7. 其他相關實驗：包括使用不同的菌株（如耐藥突變體）和不同的抗生素（如氟氯西林）進行比較實驗，以驗證CFU測定方法的侷限性。
05
資料解讀
圖1：恩諾沙星和頭孢曲松對沙門氏菌的抗菌活性較差
Figure 1 旨在評估恩諾沙星和頭孢曲松對沙門氏菌的抗菌效果，透過不同實驗條件下的生存率來比較其藥效。a. 為了評估恩諾沙星和頭孢曲松在小鼠體內和體外的抗沙門氏菌活性，作者對小鼠脾臟中的沙門氏菌生存率進行了檢測，並在正常大氣條件下37°C的Mueller–Hinton肉湯中進行了體外培養。結果顯示，在小鼠脾臟中，恩諾沙星和頭孢曲松的抗菌效果有限，體外培養的結果也顯示出類似的趨勢。每個符號代表一個獨立的小鼠或體外培養樣本，線條連線幾何平均值。b. 為了模擬組織環境，作者在化學恆溫培養系統中檢測了恩諾沙星和頭孢曲松的抗沙門氏菌活性，並與實驗室條件下的結果進行了比較。結果表明，在模擬組織環境中，這兩種抗生素的抗菌效果仍然不理想。每個符號代表一個獨立的化學恆溫培養反應器，線條連線幾何平均值。c. 為了研究不同基因型的沙門氏菌在小鼠脾臟中的生存情況，作者檢測了野生型和特定突變體沙門氏菌在恩諾沙星和頭孢曲松處理後的生存率。結果顯示，恩諾沙星處理下，野生型和lexA3突變體在1小時後的生存率相似，而tisB和Δ3T突變體的生存率有所不同。頭孢曲松處理下，野生型和Δ3T突變體的生存率也存在差異。水平線表示幾何平均值。d. 在化學恆溫培養系統中，作者檢測了野生型和特定突變體沙門氏菌在恩諾沙星和頭孢曲松處理後的生存率。結果表明，恩諾沙星處理下，野生型和lexA3突變體在1小時後的生存率相似，而tisB和Δ3T突變體的生存率有所不同。頭孢曲松處理下，野生型和Δ3T突變體的生存率也存在差異。水平線表示幾何平均值。結論：恩諾沙星和頭孢曲松在不同實驗條件下對沙門氏菌的抗菌活性較差，且不同基因型的沙門氏菌對這兩種抗生素的敏感性存在差異。
圖2：應激和營養供給對沙門氏菌殺滅的調節
Figure 2 旨在探討不同環境條件下應激和營養供給對沙門氏菌存活的影響，特別是在抗生素處理條件下的存活率變化。a. 為了研究不同條件下沙門氏菌對恩諾沙星的存活率，作者在不同條件下的恆化器培養中暴露沙門氏菌1小時。每個符號代表一個獨立的恆化器反應器。透過對pH值進行對數轉換資料的雙尾t檢驗，以及對葡萄糖和滲透壓進行對數轉換資料的方差分析，結果顯示在不同的pH、葡萄糖濃度和滲透壓條件下，沙門氏菌的存活率存在顯著差異。b. 透過在小鼠體內和恆化器中模擬組織環境培養基中研究沙門氏菌的存活情況，作者比較了在不同分裂速率下（0.083 h−1, 0.17 h−1和0.33 h−1）和不同抗生素（恩諾沙星和頭孢曲松）處理下的存活率。結果顯示，在小鼠體內和模擬組織環境培養基中，沙門氏菌的存活率隨著分裂速率的變化而變化，並且在不同的培養基和抗生素處理下也有顯著差異。c. 為了研究頭孢曲松暴露時間與沙門氏菌存活率之間的關係，作者分析了不同增殖速率和暴露時間下的存活情況。結果表明，沙門氏菌的存活率與暴露時間和增殖速率相關，資料呈現出單指數擬合的趨勢，陰影區域顯示了95%的置信區間。結論：不同的環境應激和營養供給條件顯著影響沙門氏菌在抗生素處理下的存活率，且存活率與暴露時間和增殖速率密切相關。
圖3：沙門氏菌在恩諾沙星暴露期間和之後的DNA損傷情況
Figure 3 詳細展示了沙門氏菌在暴露於抗生素恩諾沙星後的DNA損傷過程以及暴露後的恢復情況。圖3a展示了一組時間序列影像，顯示了細菌在抗生素暴露期間如何形成RecA foci。在使用恩諾沙星後，RecA-mCherry蛋白在細菌中聚集，表明DNA雙鏈斷裂（DSBs）的形成。每個紅色的RecA foci代表一次潛在的DNA損傷事件，通常在暴露於藥物後迅速出現。圖3b提供了沙門氏菌經過1小時恩諾沙星處理後，在無抗生素的環境（LB培養基）中洗脫30分鐘並繼續生長的快照。這些影像顯示了細菌開始恢復生長，表明某些細菌能夠在抗生素暴露後修復遭受的DNA損傷。圖3c以圖表形式量化了不同暴露時間段後未損傷和再生長細胞的比例。此圖透過給出1小時、2小時和4小時的處理條件，說明了經過不同時間的藥物暴露後，沙門氏菌在清洗和恢復培養期間逐步恢復生長的過程。圖中用點線表示了細菌在暴露及洗脫過程中的生長恢復曲線。最終，圖3d提供了圖3c資料的總結，量化了經恩諾沙星處理後未受損細胞的比例，及在LB培養基中的恢復生長情況和倖存者比例。圖3透過顯示長期的RecA foci形成，揭示了在恩諾沙星暴露期間及其後的DNA損傷過程。圖表顯示，大多數細菌在暴露後經歷嚴重的DNA損傷，而只有少部分細胞能夠成功修復並再生長。這表明恩諾沙星在暴露後持續影響細菌DNA的完整性，且在營養豐富的條件下特別明顯，從而影響沙門氏菌的生存。總體來看，圖3提供了有關沙門氏菌在抗生素暴露下及後續生長中DNA損傷與修復機制的重要見解。
圖4：氟氯西林對金黃色葡萄球菌的殺菌作用
Figure 4 展示了金黃色葡萄球菌（S. aureus）在暴露於第一線β-內醯胺抗生素氟氯西林（flucloxacillin）期間及之後的殺菌過程，類似於之前對沙門氏菌的研究。這一圖進一步驗證了不同病原體在抗生素治療中的動態反應。圖4a中的一系列快照顯示了表達綠色熒光蛋白（GFP）的S. aureus細胞在氟氯西林處理前、處理過程中以及隨後的恢復階段的變化。熒光影像清晰地顯示出細菌細胞在藥物存在下的狀態變化。圖4b的柱狀圖量化了不同時間段後存活的S. aureus細胞比例：分別為1小時、2小時和4小時的氟氯西林暴露。這個資料由三組獨立實驗中所觀察到的937、745和599個細胞所得。觀察顯示，雖然在抗生素處理期間許多細菌存活，但之後發生了顯著的後續殺菌現象，這說明在藥物暴露後相當長的時間內，殺菌作用仍在持續。圖4c的圖表總結了細菌在暴露期間和切換到無抗生素培養環境後的生存情況，與圖4b的資料進一步對應。這裡可以看到，暴露時間結束時的存活比例（圖中用線連線的幾何平均值表示）與最終能夠形成菌落的細胞比例之間存在顯著差異（箭頭指出了暴露後存活率的變化）。透過Figure 4的實驗證據，研究揭示S. aureus在β-內醯胺類抗生素暴露下可能不會立即死亡，而是表現出延遲的殺菌作用，且大部分細菌在暴露結束後會繼續經歷死亡過程。這種現象表明，依靠傳統的CFU方法來評估抗生素效能可能容易誤導真實的殺菌動力學，因為許多細菌是在暴露結束後的再生長階段失去活力的。圖中的發現與沙門氏菌的相似現象相吻合，說明後續殺菌可能是許多抗生素治療中普遍存在的隱性機制。這進一步強調了單細胞、即時監控技術在研究抗生素作用機制中重要的應用價值。
06
主要結論
瑞士研究團隊在《Nature》期刊上發表的研究表明，儘管在實驗室條件下，壓力誘導的細菌耐藥性和持久者（persisters）可能削弱抗菌藥物的活性，但在生理條件下，其影響有限。該研究透過小鼠模型和組織模擬的化學反應器，評估了抗菌藥物對沙門氏菌的清除效果。研究發現，沙門氏菌在感染條件下由於嚴重的營養匱乏而導致生長受限，成為抗生素清除不力的主要原因。實驗中使用的抗生素恩諾沙星和頭孢曲松在這兩種條件下均表現出較差的抗沙門氏菌活性。研究強調，應在生理條件下使用即時單細胞檢測來量化抗生素活性。
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討論總結
研究表明，沙門氏菌在生理條件下的存活能力主要受營養缺乏限制，而非細菌耐藥性或持久者的影響。儘管某些壓力因素可能會影響抗生素的活性，但其總體影響相對較小。研究還指出，傳統的菌落形成單位（CFU）測定方法可能會誤導結果，因為抗生素在洗滌後仍與其細菌靶標結合並在培養基上繼續殺死細菌。該研究建議，需採用更為準確的單細胞即時檢測方法，以更好地理解抗生素在體內的真實效力。這一發現對於未來的抗生素開發具有重要啟示，特別是在模擬營養匱乏的條件下進行藥物測試。
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