01
研究背景
DNA損傷反應（DDR）是一個複雜的通路網路，負責維持基因組的穩定性。儘管許多DDR通路的獨立功能已被詳細解析，但這些通路之間的互補作用仍然是一個挑戰。DDR中的遺傳互動作用圖譜可以揭示新的生物學見解，併為癌症治療提供精確的治療途徑。合成致死性是指細胞能夠容忍單個基因的喪失，但不能同時失去多個基因，這表明透過備用通路進行緩衝。透過CRISPR干擾（CRISPRi）雙導向篩選，研究人員系統性地繪製了548個核心DDR基因之間的遺傳互動圖譜，發現了許多新的合成致死關係。
在正常細胞穩態下，DDR會被啟用以應對從錯配到完全DNA複製叉崩潰等問題。研究表明，WDR48與USP1協同作用以抑制PCNA在FEN1/LIG1缺陷細胞中的降解，而SMARCAL1與FANCM直接解開TA富集的DNA十字結構，防止ERCC1–ERCC4複合物引起的染色體斷裂。研究結果為基因組維護提供了基本見解，併為DDR因子之間新連線的機制研究提供了基礎。透過識別新的合成脆弱性，這些發現可能在癌症治療中得到應用。
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研究發現
這篇論文研究了DNA損傷反應（DDR）中的合成致死性，揭示了在正常人類細胞穩態下生存所需的基因相互作用。研究團隊使用CRISPR干擾（CRISPRi）篩選技術，系統性地繪製了DDR核心基因之間的遺傳相互作用圖譜。透過這一方法，他們不僅捕獲了已知的相互作用，還發現了許多新的連線。研究特別關注了兩個強烈的相互作用：首先，WDR48與USP1協同作用以限制PCNA在FEN1/LIG1缺陷細胞中的降解；其次，SMARCAL1和FANCM直接解開富含TA的DNA十字結構，防止ERCC1–ERCC4複合物引發的染色體斷裂。這些發現為基因組維護提供了基本見解，併為探索DDR因子之間的新連線機制以及在癌症治療中利用合成脆弱性提供了基礎。
研究透過CRISPRi雙導向篩選，發現了大約5000個合成致死相互作用，佔所有查詢基因對的約3.4%。研究驗證了多個新的合成致死相互作用，包括LIG1:WDR48和FANCM:SMARCAL1等。實驗表明，這些相互作用在多種細胞系中表現出一致性，表明其普遍性。研究還揭示了WDR48–USP1透過對抗RAD18介導的PCNA泛素化來保護細胞免受DNA複製不足的影響，而FANCM和SMARCAL1則透過解開TA重複區域的DNA十字結構來防止染色體斷裂。這些發現不僅深化了對DDR機制的理解，還指出了潛在的癌症治療靶點。
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臨床意義
WDR48–USP1與FEN1/LIG1的合成致死性：研究發現WDR48與USP1合作抑制RAD18介導的PCNA泛素化，從而防止PCNA降解，避免DNA複製不足和基因組不穩定。這對於FEN1突變的結直腸癌等累積單鏈DNA間隙的腫瘤，可能有利用USP1抑制劑的治療潛力。 FANCM與SMARCAL1在TA重複區域的作用：研究指出FANCM和SMARCAL1的轉位酶活性有助於在正常DNA複製過程中移除可能導致染色體斷裂的十字架結構。這種合成致死關係提示SMARCAL1作為潛在的藥物靶點，尤其在FANCM突變的癌症中。 綜上所述，這些研究結果不僅為DDR路徑的機制解析提供了基礎，還為識別新的癌症治療靶點開闢了道路，特別是在與現有藥物靶點相結合時。透過這種方式，研究有望為癌症患者帶來臨床益處，尤其是在利用已知的小分子靶向合成致死性關係方面。
04
實驗策略
1. CRISPRi雙導向篩選：研究團隊開發了一種名為SPIDR的CRISPRi雙導向文庫，針對548個核心DDR基因設計約700,000個導向RNA組合，用於探測基因間的相互作用。
2. 篩選環境：實驗在未受外源DNA損傷影響的正常人類視網膜色素上皮細胞（RPE-1）中進行，以確保研究的基因相互作用是在正常細胞穩態下發生的。
3. 技術指標：透過GEMINI，一個變分貝葉斯分析工具，識別超出單基因效應的遺傳相互作用。約18%的基因在RPE-1細胞中被認為是個體必需的，無法透過標準sgRNA進行合成致死性研究，因此使用不匹配的sgRNA來減弱其影響，以便更好地捕捉相互作用。
4. 驗證與分析：透過流式細胞術和克隆存活實驗驗證關鍵基因對的合成致死相互作用。使用了獨立的流式細胞術方法來驗證新識別的遺傳相互作用。
5. 生物資訊學分析：利用STRING資料庫進行已知生物學的驗證，使用聚類分析和UMAP嵌入來識別與DDR相關的新的遺傳相互作用。
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資料解讀
圖1：綜合組合篩選識別DDR因子之間的合成關係
Figure 1 為了研究DNA損傷修復（DDR）因子之間的合成關係，作者進行了全面的組合篩選。 A. 為了識別DDR因子之間的合成關係，作者對多種DDR相關基因進行了組合敲除實驗。透過分析細胞存活率，發現某些基因組合的敲除顯著降低了細胞存活率，表明這些基因之間存在合成致死關係。 B. 為了驗證組合篩選的結果，作者對篩選出的基因組合進行了進一步的功能驗證。透過細胞增殖實驗，發現這些基因組合的敲除確實導致細胞增殖能力顯著下降。 C. 為了探討DDR因子之間的合成關係的機制，作者對篩選出的基因組合進行了分子機制研究。透過免疫印跡和免疫熒光分析，發現這些基因組合的敲除影響了DNA損傷修復通路的關鍵節點。 結論：透過綜合組合篩選，作者識別出多對DDR因子之間的合成關係，並驗證了這些關係對細胞存活和增殖的影響，揭示了其在DNA損傷修復中的潛在機制。
圖2：針對核心DNA損傷修復（DDR）基因的雙向導RNA文庫
Figure 2 為了研究核心DNA損傷修復（DDR）基因在細胞中的功能，作者構建了一個名為SPIDR的雙向導RNA（guide RNA）文庫，該文庫專門靶向548個核心DDR基因。 A. 作者將靶向548個核心DDR基因的嚮導RNA系統地組合成一個雙向導RNA慢病毒文庫，稱為SPIDR。實驗在生物學重複中進行，分別在時間點零（T0）和第14天（T14）取樣。透過這種設計，研究人員能夠篩選出在DDR過程中發揮關鍵作用的基因。 結論：透過構建和應用SPIDR雙向導RNA文庫，研究人員能夠系統地篩選和研究核心DDR基因在細胞中的功能。
圖3：透過敏感的GEMINI評分對所有成對相互作用進行排序，以識別已知的合成關係並提名新的候選者
Figure 3 為了識別已知的合成關係並提名新的候選者，作者對所有成對相互作用進行了敏感的GEMINI評分排序。圖中用洋紅色標記了已知的合成關係，用淺藍色標記了新提名的候選者。紅色虛線表示敏感的GEMINI評分為-1的閾值。 結論：透過敏感的GEMINI評分排序，圖3B成功識別出已知的合成關係，並提名了新的候選者，為進一步研究提供了潛在的研究方向。
圖4：SPIDR遺傳相互作用譜的聚類熱圖
Figure 4 為了探究SPIDR基因的遺傳相互作用，作者對其進行了遺傳相互作用譜的分析，結果以聚類熱圖的形式展示。熱圖中，具有相似遺傳相互作用的簇被標記為STRING註釋的物理相互作用亞複合體。 結論：透過對SPIDR遺傳相互作用譜的聚類分析，識別出了與SPIDR相關的物理相互作用亞複合體，揭示了SPIDR在細胞內可能的功能性複合體。
06
主要結論
這篇發表在Nature上的論文來自瑞士的科研團隊，他們利用CRISPR干擾（CRISPRi）篩選技術全面繪製了正常人類細胞在DNA損傷應答（DDR）過程中生存所需的基因互動圖譜。研究揭示了許多已知的和新的基因互動，特別是WDR48與USP1共同作用限制PCNA降解，以及SMARCAL1與FANCM直接解開富含TA的DNA十字架結構，以防止ERCC1–ERCC4複合體引發的災難性染色體斷裂。該研究為基因組維護提供了基本見解，並指出了可以在癌症治療中利用的合成脆弱性。
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討論總結
研究指出，使用雙導向CRISPRi篩選方法，他們探討了548個核心DDR基因之間約150,000個基因互動，涵蓋了所有主要的DNA修復途徑，包括必需基因。這些實驗在未經干擾的細胞中進行，揭示了細胞在日常DNA事務中生存所需的修復過程。研究發現超過5,000個高置信度的互動，重現了已知的互動，並暗示了新的因素在多種過程中發揮作用。透過這一研究，他們不僅揭示了WDR48–USP1對抗RAD18介導的PCNA降解的機制，還展示了FANCM與SMARCAL1在打破長且晚複製的富含TA的DNA重複序列上的十字架結構方面的互補作用。這些發現有助於識別可以在癌症治療中利用的合成致死關係，並可能為未來的癌症治療策略提供新的切入點。
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