01
研究背景
細胞衰老是由嚴重的細胞應激引發的一種細胞命運，其特徵包括細胞週期的穩定退出和異質的促炎性衰老相關分泌表型（SASP）的發展。SASP增加了老年動物慢性疾病的易感性和虛弱性，這促使人們開發針對衰老細胞或衰老表型的治療方法，以促進健康老齡化。儘管一些針對SASP的治療方法在減少癌症等慢性疾病負擔方面顯示出一定的前景，但SASP的分子調控及其與年齡相關疾病易感性的關係仍然知之甚少。已知SASP的許多調節因子，包括mTOR、GATA4、p38MAPK和p53。矛盾的是，p53作為衰老的主要誘導因子，卻被報道為SASP的抑制因子。然而，這一矛盾的分子解釋一直缺乏。
SASP還可以由細胞質DNA如LINE1和線粒體DNA誘導。此前的研究表明，SASP是由一種線粒體-細胞核逆向訊號通路驅動的，該通路促進了細胞質染色質片段（CCF）從衰老細胞的細胞核排出。CCF被cGAS/STING通路感知，啟用SASP的主轉錄調節因子NFkB。然而，CCF形成的分子調控及其在體內老化組織中的靶向可能性仍不清楚。本文研究識別了一條受線粒體控制的p53調節通路，該通路抑制CCF形成和SASP，同時促進衰老細胞的DNA修復和基因組完整性。研究顯示，這一通路在培養的細胞和小鼠中具有藥理學靶向性，驗證了其作為衰老幹預靶點的潛力，並突顯了p53在保護衰老細胞基因組完整性方面的功能。
02
研究發現
研究揭示了p53在衰老細胞中的重要作用，特別是在DNA修復和抑制細胞質染色質片段（CCF）形成方面。p53透過增強DNA修復能力，維持基因組完整性，從而抑制CCF的積累和隨之而來的炎症表型。透過藥理學抑制MDM2啟用p53，可以逆轉老化小鼠的轉錄組特徵，並減少與年齡相關的單核細胞和巨噬細胞在肝臟中的積累。此外，線粒體在衰老細胞中透過ATM依賴的方式調節p53活性，表明線粒體依賴的γH2A.X + CCF形成會削弱核DNA損傷訊號和p53活性。
研究還表明，p53的啟用不僅促進了DNA雙鏈斷裂的修復，還透過抑制CCF的形成來保護衰老細胞的基因組完整性。透過單核基因組重測序，研究發現p53的啟用可以防止染色體末端的大規模缺失，特別是含有端粒的CCF的形成。此外，p53的啟用在體內表現出抗炎和免疫調節的作用，特別是在老年雌性小鼠中，MDM2抑制劑HDM201能夠逆轉與年齡相關的轉錄特徵和免疫細胞組成的變化。
03
臨床意義
p53在衰老細胞中的保護作用：研究顯示，p53透過抑制CCF的積累和下游炎症表型，維持基因組完整性。這表明p53可能是治療與年齡相關疾病的重要靶點，因為它在衰老細胞中扮演了促進DNA修復和抑制炎症的雙重角色。藥物干預的潛力：研究中透過藥理學抑制MDM2來啟用p53，成功逆轉了老化小鼠肝臟中的衰老轉錄組特徵和與年齡相關的單核細胞和巨噬細胞的積累。這表明，透過靶向p53通路進行藥物干預可能有助於緩解與老化相關的炎症，從而促進健康老齡化。線粒體在p53活性中的作用：研究還發現，線粒體透過ATM依賴的方式調節p53活性，表明線粒體在CCF形成和SASP表達中的重要性。這為理解線粒體在細胞衰老中的作用提供了新的視角，並暗示了透過調節線粒體功能來影響p53活性可能成為新的治療策略。對抗炎症的潛在應用：由於p53的啟用與炎症基因表達的顯著減少有關，尤其是在老化組織中，這表明MDM2抑制劑在臨床中可能有抗炎和免疫調節的應用潛力。個體化治療的可能性：研究中觀察到的性別差異（例如在雌性小鼠中更顯著的基因表達變化）提示在應用此類治療策略時可能需要考慮個體化的因素，以提高治療效果。總之，這篇文章不僅揭示了p53在衰老細胞中的關鍵作用，還為開發針對與年齡相關疾病的新型治療策略提供了科學依據。透過進一步理解這些機制，未來可能會出現更有效的抗衰老藥物，從而改善老年人群的健康狀況。
04
實驗策略
1. 研究背景與目的：探討p53在衰老細胞中對DNA修復的促進作用及其對細胞質染色質片段（CCF）和炎症的抑制作用。研究p53如何透過調控CCF形成來抑制衰老相關分泌表型（SASP）。
2. 細胞實驗設計：使用人類成纖維細胞（IMR90）誘導衰老，利用輻射或依託泊苷處理。透過外源性表達或藥理學抑制MDM2啟用p53。檢測CCF的形成和SASP的變化，觀察p53對這些過程的影響。
3. 動物實驗設計：採用老年小鼠模型，使用臨床級MDM2抑制劑（HDM201）進行體內實驗。評估p53啟用對肝臟中炎症相關基因表達和免疫細胞組成的影響。
4. 分子生物學技術：使用qPCR和RNA-seq進行基因表達分析。透過免疫熒光染色和western blot檢測蛋白表達及修飾（如γH2A.X和p53）。採用單細胞基因組重測序評估基因組穩定性。
5. 資料分析與驗證：利用生物資訊學工具分析RNA-seq資料。透過免疫熒光和流式細胞術驗證炎症和免疫細胞的變化。
05
資料解讀
圖1：p53抑制環狀染色質碎片（CCF）的形成
Figure 1 研究了p53在輻射誘導的衰老IMR90人類成纖維細胞中對CCF形成的抑制作用。A. 為了研究輻射誘導的衰老IMR90人類成纖維細胞中CCF的形成，透過免疫熒光對CCF進行了染色。結果顯示，CCF的總數經過歸一化處理後，與細胞核總數相關聯。每個數值代表培養板中一個獨立的孔，實驗代表性為n=2。B. 為了驗證輻射誘導的衰老IMR90人類成纖維細胞中CCF的形成，進行了免疫印跡和免疫熒光染色，使用的時間框架如圖S1K所示。實驗代表性為n=2。C. 為了研究輻射後不同時間點的CCF形成情況，在指定的輻射後天數進行了免疫熒光染色。結果為3次實驗的平均值。D. 為了研究外源性p53對CCF形成的影響，在輻射誘導的衰老IMR90細胞中轉染了外源性p53或空載體，並進行了CCF和FLAG的免疫熒光染色。每個數值代表單次實驗中的獨立感染，實驗代表性為n=3。E. 為了評估細胞數量，透過細胞核數量進行了測量，並對每組進行了DMSO對照的歸一化處理。實驗代表性為n=3。F. 為了測量DNA複製，使用EdU摻入實驗進行了分析。除了n=1的增殖對照外，每個點代表一次獨立的輻射處理，實驗代表性為n=2。G. 為了研究基因表達的差異，進行了RNA測序分析，每組n=3，並總結了每個主要簇的KEGG本體。詳細的本體資訊見補充資料1。結論：p53在輻射誘導的衰老IMR90人類成纖維細胞中抑制了CCF的形成，並影響了細胞增殖和基因表達。
圖2：p53啟用促進DNA修復
Figure 2 探討了p53啟用在輻射誘導衰老的人類成纖維細胞中對DNA修復的影響。A. 為了研究p53啟用對DNA修復的影響，透過免疫熒光檢測輻射誘導衰老的IMR90人類成纖維細胞中的細胞質DNA環（CCF）形成。結果顯示，p53啟用促進了CCF的形成。B. 透過免疫熒光檢測輻射誘導衰老的IMR90細胞核內γH2A.X焦點數量，結果表明，p53啟用增加了γH2A.X焦點的數量，提示DNA損傷修復的增強。C. 透過免疫印跡檢測輻射誘導衰老的IMR90細胞中γH2A.X的表達，結果顯示，p53啟用增加了γH2A.X的表達，進一步支援其在DNA修復中的作用。D. 透過即時定量PCR分析輻射後4天的細胞中p53靶基因的表達，結果顯示，使用RG7388處理的細胞中p53靶基因的表達顯著上調，表明p53啟用增強了DNA修復相關基因的表達。E. 透過免疫熒光定量分析輻射誘導衰老的IMR90細胞中的CCF、核內γH2A.X、p21和細胞數量，結果顯示，p53啟用增加了這些標誌物的表達，進一步支援其在DNA修復中的作用。F. 透過中性彗星實驗檢測輻射誘導衰老的IMR90細胞或增殖對照細胞，結果顯示，p53啟用減少了DNA斷裂的程度，提示其在DNA修復中的保護作用。G. 透過非同源末端連線（NHEJ）報告實驗檢測輻射誘導衰老的I9A人類成纖維細胞，結果顯示，p53啟用增強了NHEJ修復途徑的活性，進一步支援其在DNA修復中的作用。結論：p53啟用在輻射誘導衰老的人類成纖維細胞中透過多種機制促進了DNA修復。
圖3：p53在衰老細胞中維持基因組完整性
Figure 3 研究了p53在輻射誘導的衰老IMR90人類成纖維細胞中對基因組完整性的保護作用。A. 為了研究輻射誘導的衰老IMR90人類成纖維細胞中的複製數變異，對單個細胞核進行了全基因組繪圖。結果顯示，增殖組、衰老組和衰老RG7388組的細胞核中存在不同的複製數變異。B. 透過預測多倍性分析，發現輻射誘導的衰老IMR90人類成纖維細胞在不同處理組中表現出不同的多倍性變化。C. 為了分析染色體缺失情況，繪製了缺失的直方圖，每條線代表每個細胞中所有染色體的聚合。結果顯示，衰老細胞中染色體缺失的分佈情況。D. 透過對輻射誘導的衰老IMR90細胞進行CENPA的免疫熒光檢測，觀察到染色體纏繞纖維（CCF）的存在，實驗中用箭頭標記了CCF。E. 使用免疫熒光原位雜交（ImmunoFISH）技術檢測了端粒和γH2A.X，結果展示了端粒和DNA損傷標記的共定位情況。F. 對D和E中的結果進行了定量分析，結果顯示CENPA+標記和端粒+標記在不同實驗中的分佈情況。資料以平均值±標準差表示，星號(*)表示p< 0.05。結論：p53在輻射誘導的衰老IMR90人類成纖維細胞中透過維持基因組完整性發揮保護作用。
圖4：MDM2i在體內具有衰老形態效應
Figure 4 研究了MDM2抑制劑（MDM2i）在體內對衰老相關指標的影響。A-B. 透過免疫印跡分析檢測小鼠肝臟中p53和p21的表達水平，結果顯示，在MDM2i處理組中，這些蛋白的表達水平與對照組相比發生了變化。定量分析表明，MDM2i處理組中p53和p21的表達顯著上調。C. 透過TAF實驗檢測雌性小鼠肝細胞中具有超過1個TAF的細胞百分比，結果表明，MDM2i處理組中具有多個TAF的肝細胞比例增加。D. 透過簡單線性迴歸分析，研究了基因表達隨年齡變化和隨HDM201處理變化之間的相關性，結果顯示，在4912個隨年齡差異表達的基因中，HDM201處理顯著影響了這些基因的表達模式。E. 熱圖展示了776個基因在HDM201處理下表達變化與年齡變化相反，以及58個未被逆轉的基因，主要的層次聚類中顯示了前五個GO生物過程術語。F. 透過Ingenuity pathway分析，展示了在老年對照組與年輕對照組（年齡效應）以及老年HDM201組與老年對照組（HDM201效應）比較中共同的上游調控因子，使用p< 1E-14作為篩選標準。G. 代表性IPA目標基因熱圖展示了STAT1的表達變化。H. 透過流式細胞術分析從脾臟和肝臟中分離的免疫細胞頻率，結果顯示，MDM2i處理對免疫細胞頻率產生了影響。結論：MDM2抑制劑在體內對衰老相關的基因表達和免疫細胞頻率具有顯著影響，表明其在調節衰老過程中的潛在作用。
圖5：線粒體在衰老過程中抑制p53活性
Figure 5 探討了線粒體在衰老過程中對p53活性的影響，特別是在輻射誘導的衰老模型中。A. 為了研究線粒體對p53活性的影響，對輻射誘導的衰老Parkin過表達IMR90人類成纖維細胞進行了免疫熒光實驗，觀察細胞質環狀DNA（CCF）和γH2A.X陽性核染色的代表性影像。結果顯示，在這些細胞中，CCF和γH2A.X陽性核染色的比例有所變化。B. 對A中實驗的定量分析顯示，輻射誘導的衰老Parkin過表達IMR90細胞中，CCF和γH2A.X陽性核染色的比例顯著增加。每個數值代表培養板中一個孔的結果，實驗重複3次。C. 為了分析p53靶基因的表達，引用了文獻22中的RNA測序資料，展示了每組平均的p53靶基因表達情況，實驗組和對照組均為3個重複。D. 透過qPCR檢測CDKN1A基因的表達，並結合免疫熒光定量分析線粒體含量和CCF，結果表明，在輻射誘導的衰老Parkin過表達IMR90細胞中，CDKN1A的表達與線粒體含量和CCF的變化相關。E. 提出了一個模型，描述了線粒體如何在衰老過程中抑制p53活性。資料以均值±標準差表示，顯著性透過雙尾t檢驗確定。結論：線粒體在輻射誘導的衰老過程中透過調節p53靶基因表達和細胞質環狀DNA影響p53活性，這可能對衰老相關的細胞功能變化有重要作用。
06
主要結論
p53透過增強DNA修復能力來維持基因組的完整性，並減少衰老細胞中的CCF積累和相關的炎症表型。研究發現，啟用p53可以抑制CCF的形成，這與DNA修復和基因組完整性的增強有關。在老齡化小鼠中，透過藥理學抑制MDM2可以啟用p53，逆轉與年齡相關的肝臟中單核細胞和巨噬細胞的積累。此外，線粒體在衰老細胞中透過ATM依賴性途徑減弱了p53的活性。這些結果揭示了一種由線粒體調節的p53訊號迴路在衰老細胞中控制DNA修復、基因組完整性以及與衰老相關的炎症。
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討論總結
研究提供了證據表明p53-CCF訊號迴路在衰老細胞中發揮重要作用，控制著DNA修復和基因組完整性。p53透過抑制CCF的形成和與DNA修復緊密相關的SASP（衰老相關分泌表型），來保護基因組的完整性。研究強調了啟用p53訊號通路有可能作為治療干預的目標，以達到抗炎和基因組穩定化的健康老齡化效果。研究還指出，MDM2抑制劑的效果在衰老小鼠中表現出性別差異，其中女性小鼠表現出更顯著的基因表達變化，提示在探索以p53為靶點的衰老幹預中需考慮性別因素。
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