01
研究背景
EGFR基因的啟用突變在歐洲和北美約10%的肺腺癌病例中出現，而在東亞的比例高達50-60%。這些突變，尤其是外顯子19缺失（ex19del）和外顯子21的L858R突變，使得腫瘤對EGFR TKI敏感，並與改善的臨床結果相關。然而，耐藥性通常會透過次級EGFR突變、EGFR下游或替代途徑的改變或小細胞肺癌（SCLC）轉化等機制發展。儘管在TKI治療下偶爾觀察到EGFR突變丟失的現象，但在TKI失效前使用免疫檢查點抑制劑的證據有限，通常認為由於腫瘤突變負荷低、浸潤減少和浸潤T細胞的克隆擴增減少導致缺乏反應。儘管如此，個性化嵌合抗原受體T細胞療法和疫苗等新治療方法正在探索中。研究表明，克隆性新抗原相比亞克隆性新抗原是更優的免疫靶點。
在這項研究中，研究者追蹤了一例EGFR突變型肺癌患者在接受奧希替尼和個性化新肽疫苗治療後的疾病進展情況。儘管疫苗針對的ex19del新抗原引發了系統性T細胞反應，但疫苗未能阻止疾病進展。研究發現，肝轉移瘤透過染色體不穩定性丟失了疫苗靶向的新抗原，並表現出一種敵對的微環境，特徵是免疫浸潤有限、CXCL9低表達和M2型巨噬細胞水平升高。研究建議，優先考慮在全基因組加倍（WGD）事件之前出現的新抗原可能會改善疫苗設計，因為這些新抗原在轉移過程中更不容易丟失。這些資料強調了透過系統的疾病進化追蹤和功能性T細胞分析來理解聯合治療期間免疫逃逸機制的重要性。
02
研究發現
研究發現，儘管系統性T細胞對疫苗靶向的EGFR exon 19缺失（ex19del）新抗原有反應，但疫苗未能阻止疾病進展。在肝轉移的過程中，疫苗靶向的新抗原透過染色體不穩定性丟失，且微環境表現出有限的免疫浸潤和高水平的M2型巨噬細胞。研究建議，優先考慮在全基因組加倍（WGD）事件前出現的新抗原可能會改善疫苗設計，因為這些新抗原更可能代表克隆性變異，且在轉移過程中不易丟失。
研究揭示了幾個關鍵發現。首先，EGFR ex19del突變在治療過程中丟失，尤其是在小細胞肺癌（SCLC）轉化的肝轉移中，這表明在EGFR TKI和免疫選擇壓力下，腫瘤可能透過丟失關鍵驅動突變來逃避治療。其次，研究發現後WGD出現的新抗原更容易在轉移過程中丟失，而前WGD的新抗原由於其在多個複製數中的存在，更不容易丟失。最後，研究強調了透過系統的T細胞反應和腫瘤進化的系統追蹤，理解免疫逃逸機制的重要性，這對於最佳化個性化免疫治療策略具有重要意義。
03
臨床意義
新抗原疫苗設計的最佳化: 研究表明，後全基因組加倍（post-WGD）的新抗原更容易在轉移過程中喪失，而前全基因組加倍（pre-WGD）的新抗原由於多複製存在，更有可能持續存在。因此，優先選擇pre-WGD的新抗原作為疫苗設計的目標可能提高療效。 免疫逃逸機制的理解: 論文揭示了免疫逃逸的複雜機制，包括染色體不穩定性導致的新抗原喪失和免疫微環境的不利條件，例如低免疫浸潤和高M2型巨噬細胞水平。這些因素可能在免疫治療失敗中扮演重要角色。 個性化治療策略的指導: 本研究強調了在EGFR TKI治療和免疫治療中，追蹤克隆動態和功能性T細胞反應的重要性，幫助理解治療抵抗和最佳化個性化治療策略。 透過深入分析腫瘤進化和免疫環境的相互作用，研究為EGFR突變肺癌的治療策略提供了新的思路，尤其在設計個性化疫苗和免疫治療組合方面具有潛在的指導價值。
04
實驗策略
1. 臨床路徑和治療方案： 患者為44歲女性，診斷為EGFR突變引起的肺腺癌。 接受了新輔助化療、放療、手術以及埃羅替尼、奧希替尼和個性化新抗原疫苗治療。
2. 新抗原疫苗設計： 利用全外顯子測序（WES）資料設計針對10個體細胞突變的個性化新抗原疫苗。 疫苗靶向包括四個克隆性前全基因組加倍（WGD）變異和五個克隆性後WGD變異以及一個亞克隆性變異。
3. 腫瘤進化追蹤： 透過全外顯子測序和迴圈腫瘤DNA（ctDNA）分析，重建腫瘤的系統發育歷史。 發現患者腫瘤在奧希替尼和疫苗治療後，肝轉移中出現了小細胞癌轉化，丟失了EGFR ex19del和其他疫苗靶向的新抗原。
4. 免疫反應分析： 使用GZMB和IFNγ Fluorospot分析T細胞對疫苗新肽的全身反應。 在疫苗接種後，檢測到針對EGFR ex19del等多種新抗原的顯著GZMB反應。
5. 免疫逃逸機制： 肝轉移中顯示出免疫微環境不友好，免疫浸潤有限，CXCL9水平低，M2巨噬細胞水平高。 研究指出後WGD新抗原更易在轉移過程中丟失，建議優先考慮前WGD新抗原用於疫苗設計。
6. 資料分析：利用TRACERx 421佇列資料，進一步驗證前WGD突變作為克隆性變異的代表性及其在轉移時的穩定性。
05
資料解讀
圖1：患者路徑概覽及疾病系統發育分析
Figure 1 展示了患者的治療路徑及其疾病的系統發育分析，重點關注了基因突變、克隆性及其與全基因組倍增（WGD）的關係。A. 為了展示患者治療路徑，作者對患者的樣本採集和分析進行了註釋，圖中標註了樣本採集的時間點及所進行的分析型別。B. 透過系統發育樹分析了疾病的基因突變情況。圖中黑色基因代表NPV靶向的突變，灰色基因代表由於溶解性問題無法納入疫苗的變異，紅色表示複製數增加，藍色表示複製數減少，綠色基因為假定的驅動基因。星號標記了導致GZMB反應的新生肽，圖中還標註了突變的克隆性及其相對於全基因組倍增（WGD）的時間。C. 透過分析迴圈腫瘤DNA（ctDNA）的平均突變等位基因頻率，展示了系統發育簇的等位基因頻率（AF）。圖中標註了野生型（WT）、立體定向消融體放療（SABR），以及樣本的採集和分析狀態（+表示已採集/已進行，-表示未採集/未進行），並標註了EGFR擴增（EGFRamp）。結論：圖1透過詳細的患者路徑和疾病系統發育分析，揭示了疾病的基因突變特徵及其克隆性，為理解疾病進展和治療提供了重要資訊。
圖2：疫苗和非疫苗新抗原肽的免疫反應隨時間的變化
Figure 2 展示了在接種疫苗後的不同時間點，外周血單個核細胞（PBMCs）對疫苗和非疫苗新抗原肽的免疫反應。A. 為了評估疫苗和非疫苗新抗原肽在疫苗接種後40個月對PBMCs的免疫反應，作者進行了GZMB Fluorospot召回實驗。結果顯示，疫苗新抗原肽組的GZMB釋放顯著高於非疫苗組。B. 透過Fluorospot定量分析了疫苗接種後40個月PBMCs中GZMB的釋放量。結果顯示，疫苗組的GZMB釋放量顯著高於非疫苗組，統計分析顯示*pAdj< 0.05, ****pAdj< 0.0001。C. 透過MANAFEST分析了EGFR和病毒（CEF）肽在不同時間點的特定CDR3β鏈序列的數量變化。結果顯示，與疫苗接種前（第30個月）相比，EGFR和CEF肽的特定CDR3β鏈序列數量顯著增加。D. 透過MANAFEST分析了在不同時間點樣本中特定CDR3s佔據的比例。結果顯示，特定CDR3s對不同肽的反應在時間上存在變化。E. 使用CIBERSORTx分析了TRACERx 421佇列及RUL和SCLC轉化肝轉移中的基質（CD10和CD31）、免疫（CD45）和上皮/癌細胞（EPCAM）的丰度。結果顯示，不同細胞型別的丰度在不同樣本中存在差異。結論：疫苗接種後，PBMCs對疫苗新抗原肽的免疫反應顯著增強，特定CDR3β鏈序列的數量和比例隨時間變化，反映了免疫系統對疫苗的持續反應。TRACERx 421佇列分析揭示了不同細胞型別在腫瘤區域中的丰度差異。
圖3：來自具有WGD證據的腫瘤區域的所有WGD前突變的克隆性
Figure 3 展示了在研究中分析的TRACERx 421佇列中的腫瘤區域中，與基因組倍增（WGD）相對時間的克隆前後的突變比例。具體來說，這張圖表明，儘管有一些兩次WGD事件的腫瘤存在，使得一些突變在WGD時間上歸類為“模糊”，但在大多數情況下（99.4%中位數），在WGD之前發生的突變在這些腫瘤區域中仍然是克隆的。圖中的每一列代表TRACERx 421佇列中的一個單一區域，反映了相對於WGD事件的突變分類。這暗示了在這些NSCLC病例中，WGD前出現的突變在腫瘤演變中更具代表性，通常是克隆的。這意味著它們更穩定，並且在腫瘤的擴散和進展期間不太可能丟失。這一點非常重要，因為在治療研究中，選擇具有克隆特徵的突變作為靶點，可以提高免疫療法或疫苗療法的效果和穩定性。這一發現也佐證了研究中提出的思路，即在設計個性化免疫治療方案時，優先考慮選擇在WGD前發生的突變，這可能會帶來更好的臨床結果。
06
主要結論
在EGFR突變型肺癌的治療過程中，透過使用奧希替尼（osimertinib）和個性化的新抗原肽疫苗（NPV），可以發現疾病進展中的關鍵抗性機制。研究展示了一例44歲女性的病例，其初始的EGFR exon19缺失突變（ex19del）在治療後發生了丟失。不僅在治療的過程中演變出一種不再依賴EGFR路徑的異質性細胞群，並且這個細胞群表現出染色體不穩定性，導致目標新抗原的丟失。研究透過詳細的系統T細胞反應和循證DNA分析，確定了腫瘤免疫逃逸和治療抵抗的機制。儘管在疫苗接種後檢測到全身性T細胞對新抗原的反應，例如ex19del和T790M，但這些免疫反應未能阻止疾病的進展。研究強調，後WGD突變更容易在腫瘤進展中丟失，而前WGD的突變由於存在於多個DNA複製中，更具穩定性和克隆性，從而成為更適合的免疫治療靶點。此外，透過對TRACERx 421佇列的大規模資料分析，驗證了前WGD突變在臨床應用中的重要性。研究建議，在設計個性化免疫治療時，應優先選擇前WGD突變，以減少因TKI或免疫選擇壓力導致的抗原丟失，提高療效。這些發現為未來的免疫治療策略提供了寶貴的見解，強調了疾病譜系跟蹤和功能性T細胞分析在理解和克服治療失敗中的價值。
07
討論總結
研究深入探討了針對肺癌EGFR突變的個性化治療策略中的相關挑戰和潛在解決方案。研究揭示了在奧希替尼（osimertinib）和個性化新抗原疫苗（NPV）治療過程中，一名患者丟失EGFR exon19缺失突變（ex19del）的特殊病例。作者指出，儘管EGFR T790M突變的丟失是已知的抵抗機制，但類似的EGFR驅動突變丟失僅在少數臨床病例中被觀察到。此發現提示未來的治療方案需要更靈活的應對策略，以應對可能的免疫選擇壓力。文中強調了腫瘤異質性和免疫微環境對治療結果的重要影響。在肝轉移的中小細胞肺癌（SCLC）中，顯著的免疫抑制性環境、低CXCL9表達以及高M2巨噬細胞比例被認為是阻止有效免疫監視的因素。研究主體之一是，儘管系統性的新抗原特異性T細胞反應已經被檢測到，但由於微環境的“敵對性”，有效的抗腫瘤反應未能實現。這一點突出表明了改善免疫細胞浸潤的必要性，尤其是在肝轉移灶中，這被認為對當前的免疫治療方法構成了顯著挑戰。此外，研究拓展討論了在免疫治療設計中，選擇克隆性免疫靶標的重要性。透過對TRACERx 421資料集的分析，研究者證實前WGD突變更具有克隆性，並且在腫瘤演變過程中更為穩定。因此，作者建議在個性化免疫治療中優先考慮前WGD突變，以最佳化治療效果。這一策略反映了在個性化治療中細緻設計和耐心驗證的重要性。綜合來看，論文呼籲未來的研究應繼續沿著這條道路探索，結合多種策略協同提升癌症免疫療效，包括聯合檢查點抑制劑和以新抗原為基礎的疫苗，以實現更好的患者治療結果。研究凸顯了譜系追蹤和T細胞分析在揭示免疫逃逸與治療抵抗核心問題時不可或缺的作用。
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