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研究背景
調節性T細胞（Treg細胞）在維持機體免疫平衡中扮演著重要角色，其功能的缺陷常常與多種自身免疫性疾病有關。Treg細胞的特徵在於其特異性表達的主轉錄因子FOXP3，這一蛋白的表達對Treg細胞的免疫抑制功能至關重要。近年來，科學家們一直希望利用Treg細胞在癌症、器官移植和自身免疫疾病等領域的潛力。然而，如何在體外有效且穩定地誘導Treg細胞一直是一個巨大的挑戰。在體外環境中，透過誘導型Treg細胞（iTreg）的方式實現T細胞向Treg細胞的轉變通常依賴於TGFβ和IL-2的聯合刺激，但是，這些誘導獲得的iTreg細胞表現出不穩定性，特別是在FOXP3表達的持續性方面，這大大限制了iTreg細胞的臨床應用。因此，深入瞭解FOXP3的調控機制以及Treg細胞分化的內在過程成為當前研究的重要課題。
隨著CRISPR基因組編輯技術的快速發展，全基因組CRISPR篩選已經成為解析複雜基因網路和細胞調控機制的有力工具。日本的科研團隊利用這一技術，針對人初級CD4+ T細胞進行大規模CRISPR篩選，旨在系統性地識別FOXP3表達的潛在調控因子。在這項發表於《Nature》期刊的研究中，作者透過進行CRISPR失活篩選，關注在iTreg轉化過程中被啟用的人T細胞。研究發現RBPJ-NCOR抑制複合物作為FOXP3表達的新型抑制調控者，對iTreg分化和功能具有影響。RBPJ的敲除不僅增強了iTreg細胞的分化效率和功能穩定性，而且在體內測試中表現出改善的免疫抑制功能。這一發現不僅揭示了FOXP3調控的新的潛在機制，還為透過基因編輯提高iTreg細胞穩定性和功能性，進而推動自身免疫性疾病的細胞治療提供了新的思路和方向。透過這種方式，研究為提高細胞治療的有效性帶來了令人振奮的前景。
02
研究發現
這篇論文透過全基因組CRISPR篩選揭示了人類T細胞中FOXP3的調控因子，特別是發現了RBPJ-NCOR抑制複合體作為FOXP3表達的新的負調控因子。研究表明，RBPJ的敲除可以增強誘導型調節性T細胞（iTreg）的分化和功能，而不依賴於經典的Notch訊號通路。透過反覆的細胞因子和T細胞受體訊號刺激，RBPJ缺失的iTreg細胞表現出比對照細胞更高的表型穩定性，這透過FOXP3增強子CNS2的DNA去甲基化來加強FOXP3的表達。此外，RBPJ缺失的人類iTreg細胞在小鼠模型中更有效地抑制了異種移植抗宿主病（GvHD），表明RBPJ的調控可能是提高自身免疫病細胞治療效果的新途徑。
研究發現RBPJ是iTreg細胞系分化的特定負調控因子，其缺失透過增加FOXP3表達、CNS2去甲基化、區域性組蛋白乙醯化和效應基因表達來改善iTreg細胞的轉換、穩定性、維持和功能。研究還表明，RBPJ缺失的iTreg細胞在體內功能增強，並在小鼠模型中對抗移植物抗宿主病（GvHD）提供了保護。這些發現為理解Treg分化的分子基礎和開發基於iTreg的自身免疫和其他炎症性疾病治療提供了重要的見解。
03
臨床意義
RBPJ抑制作用：研究揭示RBPJ–NCOR抑制複合物作為FOXP3表達的負調節因子，其靶向性敲除可增強iTreg細胞的分化和功能，這種效應是獨立於經典Notch訊號通路的。RBPJ缺失的iTreg細胞表現出更高的表型穩定性，這主要是透過FOXP3增強子CNS2的DNA去甲基化來實現的，從而加強了FOXP3的表達。 增強Treg細胞功能：在小鼠模型中，RBPJ缺失的人類iTreg細胞在抑制異種移植物抗宿主病（GvHD）方面表現出更高的有效性，這表明RBPJ的調控可能在臨床上提高自體免疫疾病細胞治療的效率。 提供新的治療靶點：研究結果揭示了FOXP3的新型調節因子，特別是RBPJ作為iTreg細胞特定的負調節因子，這為透過基因編輯技術改進iTreg細胞在自體免疫和其他炎症性疾病的療效提供了新的可能性。 綜上所述，這項研究不僅加深了對Treg細胞分化分子基礎的理解，還為開發新型免疫調節療法提供了重要的基因靶點和策略。未來的臨床應用中，可以透過RBPJ的調控來增強iTreg細胞的穩定性和功能性，從而提高自體免疫疾病治療的效果。
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實驗策略
1. 全基因組CRISPR篩選：研究團隊在初級人類CD4+ T細胞中進行iTreg分化時，使用CRISPR-Cas9技術進行全基因組缺失篩選，識別與FOXP3誘導相關的調控因子。
2. 單細胞解析度的Perturb-icCITE-seq：為了精細分析每個基因的擾動對FOXP3誘導的影響，研究結合CRISPR敲除與單細胞RNA測序及蛋白檢測，透過Perturb-icCITE-seq技術進行驗證。
3. 靶點驗證：透過個體基因的敲除實驗來驗證篩選出的候選調控因子的功能，進一步驗證RBPJ作為FOXP3的負調控因子。
4. 機制探究：透過研究RBPJ與HDAC3的相互作用，揭示RBPJ透過調節FOXP3啟動子區域的組蛋白去乙醯化來抑制FOXP3表達。
5. 功能評估：在體外和體內模型中評估RBPJ敲除對iTreg細胞穩定性和功能的影響，發現RBPJ缺失可提高iTreg細胞的穩定性和免疫抑制活性。
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資料解讀
圖1：全基因組CRISPR篩選揭示了初級人T細胞中FOXP3誘導的新調節因子
Figure 1 為了識別在初級人T細胞中調控FOXP3誘導的新基因，研究者們進行了全基因組CRISPR篩選。 A. 為了識別調控FOXP3表達的基因，研究者們在初級人T細胞中進行了全基因組CRISPR篩選。透過分析篩選結果，發現了一些基因的敲除會顯著影響FOXP3的表達水平。 B. 透過對篩選結果的進一步分析，研究者們驗證了部分基因的功能，發現這些基因在FOXP3的誘導過程中起重要作用。 結論：透過全基因組CRISPR篩選，研究者們在初級人T細胞中識別出了一些新的基因，這些基因在FOXP3誘導過程中起到關鍵調節作用。
圖2：使用Perturb-icCITE-seq驗證FOXP3調節因子
Figure 2 A. 為了驗證FOXP3調節因子，作者使用Perturb-icCITE-seq技術對細胞進行了處理。透過分析細胞的基因表達譜，結果顯示特定基因的敲除或過表達會影響FOXP3的表達水平。 B. 透過Perturb-icCITE-seq技術，作者進一步分析了不同基因對FOXP3表達的調節作用。結果表明，某些基因的調節顯著影響FOXP3的表達，提示這些基因可能是FOXP3的重要調節因子。 結論：透過使用Perturb-icCITE-seq技術，研究驗證了多種基因在FOXP3調控中的作用，識別出可能影響FOXP3表達的重要調節因子。
圖3： RBPJ敲除提高了誘導型調節性T細胞（iTreg細胞）中FOXP3的表達、功能和穩定性
Figure 3 A. 為了研究RBPJ敲除對iTreg細胞中FOXP3表達的影響，作者對RBPJ敲除的iTreg細胞進行了流式細胞術分析。結果顯示，RBPJ敲除後，iTreg細胞中FOXP3的表達水平顯著提高。 B. 為了評估RBPJ敲除對iTreg細胞功能的影響，作者透過抑制實驗檢測了RBPJ敲除iTreg細胞的抑制能力。結果表明，RBPJ敲除的iTreg細胞表現出更強的抑制能力。 C. 為了驗證RBPJ敲除對FOXP3穩定性的影響，作者進行了蛋白質降解實驗。結果顯示，RBPJ敲除後，iTreg細胞中FOXP3蛋白的穩定性顯著增強。 結論：RBPJ的敲除能夠提高iTreg細胞中FOXP3的表達、功能和穩定性，表明RBPJ可能在調節iTreg細胞的功能中發揮重要作用。
圖4：RBPJ–NCOR–HDAC3複合物透過調節區域性組蛋白乙醯化直接抑制FOXP3
Figure 4 A. 為了探究RBPJ–NCOR–HDAC3複合物對FOXP3的直接調控作用，作者使用染色質免疫沉澱（ChIP）實驗分析了該複合物在FOXP3啟動子區域的結合情況。結果顯示，RBPJ–NCOR–HDAC3複合物在FOXP3啟動子區域有顯著結合。 B. 為了驗證RBPJ–NCOR–HDAC3複合物對FOXP3表達的影響，作者透過即時定量PCR分析了複合物對FOXP3 mRNA水平的調控。結果表明，RBPJ–NCOR–HDAC3複合物的存在顯著降低了FOXP3的mRNA表達水平。 C. 為了進一步探討RBPJ–NCOR–HDAC3複合物對組蛋白乙醯化的影響，作者進行了組蛋白乙醯化水平的檢測。結果顯示，RBPJ–NCOR–HDAC3複合物的存在導致FOXP3啟動子區域組蛋白乙醯化水平的降低。 結論：RBPJ–NCOR–HDAC3複合物透過結合FOXP3啟動子區域並降低其組蛋白乙醯化水平，直接抑制了FOXP3的表達。
圖5：RBPJ的去除提高了誘導型調節性T細胞（iTreg）在體內的穩定性和抑制功能
Figure 5 A. 為了研究RBPJ去除對iTreg細胞穩定性的影響，作者透過在小鼠體內移植iTreg細胞，並在不同時間點檢測其Foxp3表達水平。結果顯示，缺失RBPJ的iTreg細胞在體內的Foxp3表達水平更為穩定。 B. 為了評估RBPJ去除對iTreg細胞抑制功能的影響，作者在小鼠體內進行共培養實驗，檢測其對效應T細胞增殖的抑制能力。結果表明，RBPJ缺失的iTreg細胞具有更強的抑制效應T細胞增殖的能力。 C. 為了進一步驗證RBPJ去除對iTreg細胞功能的影響，作者透過體內實驗檢測其對炎症反應的抑制效果。結果顯示，缺失RBPJ的iTreg細胞能夠更有效地抑制炎症反應。 結論：RBPJ的去除能夠提高iTreg細胞在體內的穩定性和抑制功能，這表明RBPJ可能在調節iTreg細胞功能中發揮重要作用。
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主要結論
RBPJ-NCOR複合物是FOXP3表達的負調控因子，敲除RBPJ能夠顯著增強誘導性Treg細胞（iTreg）的分化、穩定性和功能性。研究透過全基因組CRISPR篩選鑑定出RBPJ作為影響FOXP3誘導轉錄的關鍵抑制因子，不依賴於經典的Notch訊號通路。敲除RBPJ基因的iTreg細胞能夠促進FOXP3的表達和表觀遺傳特徵的穩定性，例如DNA去甲基化和組蛋白乙醯化，這些變化使得iTreg細胞在面對炎症訊號時更加穩定。進一步的體外和體內實驗表明，RBPJ敲除後的iTreg細胞在抑制移植物抗宿主病（GvHD）方面具有優於對照細胞的效果，並增強了iTreg細胞在自身免疫性疾病中的應用潛力。總之，該研究揭示了RBPJ作為iTreg細胞潛在治療靶點的有效性，以及其在改善細胞治療方法中的重要意義。
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討論總結
研究對發現的RBPJ作為iTreg細胞的負調控因子的意義進行了深入探討。首先，研究填補了Treg細胞分化調控網路的空白，為FOXP3表達的負向調控機制提供了新視角。以往的研究主要集中在FOXP3正向調控因子的識別，而該研究首次透過全基因組CRISPR篩選發現RBPJ不僅作為FOXP3的負調控因子，還能直接影響iTreg細胞的免疫抑制功能。研究在單細胞水平上驗證了RBPJ敲除所帶來的大範圍轉錄組變化，這些變化包括關鍵Treg功能基因如IL2RA和ENTPD1的上調，這些基因的表達增強了iTreg細胞在以往難以抑制的炎症環境中的穩定性和功能性。此外，RBPJ調控的特異性體現了其在iTreg細胞和自然Treg細胞中的不同效應，為細胞治療過程中的精細化靶向干預鋪平了道路。其次，研究強調了RBPJ敲除對臨床轉化的重要性。研究指出，RBPJ的敲除不僅在體外增強了iTreg的分化和功能，還在體內對移植物抗宿主病（GvHD）模型中表現出顯著的免疫抑制效果，這為未來在臨床上使用iTreg進行治療提供了切實可行的依據。傳統上，Treg細胞的應用受限於其穩定性和功能性，而RBPJ敲除策略透過基因組編輯克服了這些障礙，提供了一種改進後的細胞治療方案。此外，由於RBPJ調控的獨特機制，該研究為進一步深入探索FOXP3的表觀遺傳調控提供了新的研究方向。因此，該研究不僅為基礎免疫學研究提供了新的見解，而且在實際應用中也展示了潛在的臨床效用，期待在未來的研究中進一步驗證和拓展這些發現。
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