選擇性壓力下的適應性：研究表明，在缺乏選擇性壓力的情況下，高複製數的ecDNA會對PDAC細胞造成適應性代價。然而，在特定選擇性壓力下，攜帶高ecDNA複製數的細胞表現出生存優勢。這提示在治療過程中，可能需要考慮如何透過打破這種選擇性壓力來抑制腫瘤細胞的適應和進化。
MYC基因的異質性：研究指出，MYC基因的劑量變化影響了癌細胞對基質微環境因子的依賴性和細胞形態。瞭解MYC異質性的基因機制將推進對疾病進展和轉移的理解，可能為開發靶向MYC的治療方法提供新思路。
ecDNA的治療潛力：由於ecDNA在推動腫瘤異質性和耐藥性方面的關鍵作用，靶向ecDNA或相關基因調控機制可能成為新的治療策略，以克服治療耐藥性和抑制腫瘤進展。
綜上所述，這項研究揭示了ecDNA在PDAC中的重要作用，為未來的研究和臨床治療提供了方向，尤其是在個性化治療和耐藥性管理方面。
研究基於從39個胰腺導管腺癌原發腫瘤中建立的41個早期傳代患者來源的類器官（PDOs）。
使用全基因組測序（WGS）分析這些PDOs的基因組變化。
使用AmpliconArchitect工具重建與高複製數增益相關的基因組區域，並將其分類為線性、斷裂融合橋（BFB）、複雜或ecDNA擴增子。
透過靶向測序進一步分析ecDNA基因擴增模式與關鍵突變驅動因素之間的關係。
透過整合PDO基因組、轉錄組和原位分析，研究ecDNA中的MYC擴增如何驅動廣泛的複製數異質性，以及PDAC細胞對基質利基因子消耗的形態和表型適應。
使用FISH技術驗證MYC在ecDNA上的存在，並量化MYC基因複製數在不同細胞核內的變異性。
在WNT缺乏條件下，研究MYC擴增對細胞適應性的影響。
透過去除和重新引入WNT因子，觀察PDOs的生存和適應能力。
透過基因組和轉錄組資料整合分析，排除適應過程中WNT通路的替代啟用。
使用CIRCLE-seq和ddPCR等技術驗證ecDNA結構和複製數變化。
A. 為了分類PDOs（患者來源的類器官），使用AmpliconArchitect對每個樣本的擴增子數量進行了分析，並透過顏色編碼顯示了患者在切除時的病理階段和隨訪時的生存狀態。
B. 透過AmpliconArchitect重建的擴增子結構展示了包含MYC基因座的類器官的基因組檢視，顯示了覆蓋深度、複製數片段和結構變異連線。
C. 圓形圖顯示了在四位患者的原發腫瘤中識別出的擴增子區域在匹配的類器官中得以保留。
D. Oncoplot展示了在被分類為ecDNA+（紅色）和ecDNA−（藍色）的PDOs中發生改變的基因。透過Fisher精確檢驗（雙側）識別特定基因的基因組改變與ecDNA狀態之間的關聯，P值小於0.1的結果被顯示，顯著性（P< 0.05）用橙色標出。
E. Lollipop圖展示了基因集富集分析結果，顯示在ecDNA+ PDOs（n = 7）中顯著富集的Hallmark通路。P值透過多層次分裂蒙特卡洛方法計算。
F. 箱線圖展示了在ecDNA+ PDOs中富集的CX9染色體不穩定性特徵。箱線圖顯示了中位數（中心線）、上下四分位數（箱體邊界）和1.5倍四分位距（須）。n = 29 PDOs（ecDNA−）和n = 12 PDOs（ecDNA+）。統計顯著性透過雙側Wilcoxon秩和檢驗評估。
G. 基因集富集分析展示了ecDNA+（n = 7）和ecDNA−（n = 7）PDOs在CIN70轉錄組特徵中的差異表達基因。P值透過多層次分裂蒙特卡洛方法計算。紅色虛線表示富集分數的最大值和最小值。
結論：透過對PDOs的基因擴增特徵進行詳細分析，發現ecDNA的存在與特定基因組改變和染色體不穩定性特徵相關聯，提示ecDNA可能在胰腺導管腺癌的基因組變異中發揮重要作用。
A. 為驗證MYC在ecDNA上的存在，使用熒光原位雜交（FISH）對VR01和VR06 PDOs進行了檢測。左側展示了代表性的FISH影像，中間的堆疊條形圖顯示了在VR01-O（n=15）和VR06-O（n=23）中ecDNA+中期細胞的頻率。右側量化了每個中期細胞中的MYC訊號作為ecDNA複製數的代理，結果顯示VR01-O和VR06-O中MYC訊號的數量。
B. 對VR01-O和VR06-O的間期細胞核進行了FISH檢測，左側展示了代表性的FISH影像。右側量化了每個細胞核中的MYC訊號作為ecDNA複製數的代理，結果顯示VR01-O（n=238）和VR06-O（n=227）中MYC訊號的數量。
C. 透過自相關函式g(r)對間期訊號進行了聚類分析。使用雙側Wilcoxon檢驗在r=0處與隨機分佈（灰色）進行比較，得出P值。
D. 展示了嵌入ecMYC的類器官的代表性FISH影像，左側為影像。右側的直方圖顯示了來自VR01-O、VR06-O和VR23-O的七個獨立類器官中每個細胞的MYC訊號分佈。
E. 提供了VR06 ecMYC片段的基因組檢視（頂部，灰色突出顯示）以及MYC和PVT1的位置。中間部分顯示VR06 ecMYC上缺失的PVT1起始區域（箭頭）。底部展示了兩個ecMYC PDOs（藍色）與非ecDNA培養物（白色）相比的MYC和PVT1標準化表達值（Z分數）。
F. 對VR01原發性（VR01-P）和VR06-P組織進行了FISH檢測，左側展示了代表性影像。右側量化了VR01-P（n=200）和VR06-P（n=172）中每個細胞核的MYC訊號點數量。
結論：ecDNA在PDAC中促進了MYC複製數的異質性，可能透過影響MYC和PVT1的表達來調節腫瘤的生物學特性。
A. 為了研究MYC狀態對PDOs在WNT激動劑撤除（WR）後的獨立性，將PDOs按MYC狀態分類，結果顯示MYC擴增的PDOs能夠獲得對WNT激動劑的獨立性。實驗進行了三次獨立重複。
B. 透過記錄獲得WRi表型所需的天數，資料以平均值±標準差表示，結果來自三次實驗。
C. 透過從基因組DNA中定量分析慢病毒條形碼比例，發現頻率超過10%的條形碼被標記為彩色。P0表示親本培養物。
D. 比較了VR01 WRi-1和VR01 WRi-2中假定的ecDNA的結構差異（左），以及這些ecDNA上基因的表達情況（右）。
E. 在VR01中使用中期FISH訊號檢測WRi出現前後MYC ecDNA+的中期頻率，結果顯示在基線和WRi後有顯著差異。比例的統計學顯著性透過Fisher精確雙側檢驗計算。
F. 使用ddPCR檢測基線和在有（+WR）或無（−WR）WNT激動劑培養後的MYC複製數，資料為三次生物重複的平均值±標準差。P值透過單因素方差分析和Tukey多重比較檢驗計算。
G. 使用間期FISH訊號檢測WRi出現前後MYC複製數，結果顯示在基線（+WR）和WRi培養物中有顯著差異。P值透過Wilcoxon秩和雙側檢驗計算，紅色虛線表示中位數複製數狀態。
H. 在有（+WR）或無（−WR）WNT激動劑培養的PDOs中，EdU+和EdU−細胞核的頻率顯示出顯著差異。MYC複製數按EdU狀態分層，資料為平均值±標準差。P值透過雙尾Student's t檢驗計算。定量總結來自一次實驗的資料，分析的細胞核數量分別為VR01 +WR n = 136, VR01 −WR n = 197, VR06 +WR n = 121和VR06 −WR n = 106。
結論：ecMYC透過增加MYC複製數和調整基因表達，促進PDOs在WNT激動劑撤除後的適應性。
A. 為了研究MYC和γH2AX在ecMYC類器官中的表達，進行了免疫熒光實驗。結果顯示，在基線條件下，MYC和γH2AX的熒光強度在不同的PDO培養物中呈現出相關性（Pearson相關係數）。這表明MYC的表達與DNA損傷之間可能存在聯絡。
B. 在三種條件下（基線+WR、WRi和外源性MYC過表達ORF）進行了MYC和γH2AX的免疫熒光實驗。結果顯示，MYC和γH2AX在不同條件下的表達水平存在顯著差異，尤其是在外源性MYC過表達條件下，MYC和γH2AX的表達顯著增加。這提示MYC過表達可能導致DNA損傷的增加。
C. 透過免疫FISH實驗，檢測了在WRi PDOs中培養3天后，新增或不新增WNT激動劑的條件下，MYC ecDNA和EdU的表達。結果顯示，EdU陽性和陰性細胞核在不同條件下的頻率不同，且根據EdU狀態，MYC複製數也有所不同。這表明WNT訊號可能影響MYC ecDNA的複製和細胞增殖。
D. 設計了一個實驗方案，透過FISH檢測在±WR培養30天后的VR01 WRi細胞的中期分裂相。結果顯示，MYC ecDNA陽性中期分裂相的頻率在不同培養條件下存在顯著差異，提示WNT訊號可能影響MYC ecDNA的穩定性。
E. 透過FISH檢測，觀察了在±WR培養30天后的WRi VR01細胞的間期。結果顯示，MYC點在細胞核中的數量在不同培養條件下有所變化，表明WNT訊號可能影響MYC ecDNA的分佈。
F. 在重新引入WNT激動劑30天后，VR01和VR06的MYC ecDNA複製數分佈發生了變化。結果顯示，WNT訊號的重新引入可能導致MYC ecDNA複製數的重新分佈。
結論：研究表明，細胞內ecDNA含量的升高與細胞適應性之間存在複雜的關係，尤其是MYC基因的表達與DNA損傷標誌物γH2AX的表達相關。WNT訊號在調控MYC ecDNA的穩定性和分佈中發揮重要作用。
A. 為了觀察VR06-P樣本中腫瘤上皮的不同形態，進行了蘇木精和伊紅染色。結果顯示，ROI-1和ROI-3區域的腫瘤上皮形態存在差異。
B. 透過對VR06-P樣本的ROI-1和ROI-3區域進行間期熒光原位雜交（FISH）分析，檢測了每個細胞核中MYC複製數的分佈，並計算了每個ROI的平均MYC複製數。結果表明，ROI-1和ROI-3區域中MYC擴增（定義為複製數>5）的細胞核比例存在顯著差異。
C. 對VR01-P樣本的ROI-1和ROI-2區域進行間期FISH分析，檢測每個細胞核中MYC複製數的分佈，並計算每個ROI的平均MYC複製數。結果顯示，ROI-1和ROI-2區域中MYC擴增的細胞核比例也存在顯著差異。
D-E. 使用Xenium空間圖譜技術，展示了VR06和VR01樣本中選定ROI區域內上皮細胞中LGR5的定位，以及表達LGR5的上皮細胞和表達經典WNT配體的癌症相關成纖維細胞（CAFs）的頻率。結果表明，這些細胞在不同ROI區域中的分佈存在顯著差異。
F. Xenium空間圖譜顯示了腫瘤細胞被分類為經典型或基底樣的定位。結果表明，在每個組織的指定ROI區域內，不同上皮亞型的分佈情況，並在圖中標註了MYC擴增區域與否。
結論：透過空間對映技術，研究揭示了ecDNA驅動的MYC擴增在不同上皮細胞狀態中的分佈差異，以及與LGR5表達和WNT訊號通路相關的細胞型別的空間分佈特徵。
論文討論了外染色體DNA（ecDNA）如何作為腫瘤內異質性和治療抵抗的重要介導者。透過研究，他們發現ecDNA不僅僅是複製數的簡單增加，還可能受到其與轉錄中心的定位和聚集的影響。尤其是在胰腺導管腺癌（PDAC）中，致癌基因如MYC的擴增對腫瘤的演化有顯著的影響。
研究還表明，MYC的ecDNA擴增在缺乏特定微環境的選擇壓力時，會對癌細胞施加生物負擔，但同樣允許它們在特定條件下迅速適應。此外，ecDNA不僅影響癌基因的表達水平，還會透過調節基因的轉錄程式，指導癌細胞形態的變化。
研究認為，這項研究不僅深化了對PDAC中基因組可塑性的理解，也為開發靶向治療提供了新的視角。MYC的異質性和這種調控機制的解碼，為未來的治療策略指明瞭方向。這些發現強調了透過靶向ecDNA途徑，可能有助於抑制腫瘤的進展和改善治療效果。