四川大學最新Nature，第一完成單位！

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8月11日，四川大學華西醫院生物治療國家重點實驗室蘇昭銘團隊，聯合美國斯坦福大學Wah Chiu和Rhiju Das團隊，共同在Nature雜誌上線上發表了最新研究成果“Cryo-EM Structures of Full-Length Tetrahymena Ribozyme at 3.1 Å Resolution”。該研究採用單顆粒冷凍電鏡技術首次解析了全長四膜蟲核酶在無底物結合狀態（apo）和底物結合狀態（holo）的高分辨結構（圖1）。

RNA具有重要的生物學功能，很多非編碼RNA可以摺疊成複雜的三維結構以行使或參與重要的生命過程，如催化、轉錄和翻譯調控等。但由於RNA三維結構資訊的匱乏，導致目前對RNA三維結構與功能間關係的認知仍相對有限。冷凍電鏡現已成為生物大分子結構解析不可或缺的技術，然而由於RNA結構本身較強的不均一性，因此純RNA冷凍電鏡高分辨結構的獲得依然是很大的挑戰。此前，冷凍電鏡資料庫中僅有不到10個解析度優於5 Å的純RNA結構，最高解析度是3.7 Å。

四膜蟲I類自剪接內含子（Tetrahymena group I self-splicing intron）是由美國科學家Tom Cech發現的首個在沒有蛋白參與情況下具備酶催化活性的RNA，隨後被命名為核酶（ribozyme），Tom Cech也因為這個發現獲得了1989年的諾貝爾化學獎。四膜蟲核酶的核心區域P3-P9具有非常緊湊的三維結構來形成酶催化位點，它也成為了研究RNA三維結構與催化功能關係的重要模型。

圖1. 四膜蟲核酶holo狀態結合底物後進行催化反應。5’ 外顯子（黃色）和3’ 外顯子（橙色）在核酶的作用下連線形成外顯子並最終離開四膜蟲核酶。

“雖然Tom Cech之前解析了P3-P9區域3.8 Å的晶體結構，但包含周邊區域的完整全長結構仍舊未知，這極大限制了人們瞭解四膜蟲核酶周邊區域如何遠端調控核酶活性的結構機制。此外，3.8 Å的解析度也不足以鑑別出很多參與催化反應的關鍵金屬離子。”本研究第一和共同通訊作者蘇昭銘研究員說道，“因此，解析四膜蟲核酶的完整結構對於研究其結構功能關係尤為重要，同時對運用冷凍電鏡研究其他RNA的結構與功能都具有重要參考意義。”

本研究透過解析四膜蟲核酶的高分辨冷凍電鏡結構，對不同結構域間的互作關係進行了深度解析，具體發現如下：

（1）首先揭示了apo狀態下L-21 ScaI核酶的3.1 Å全長冷凍電鏡結構，這也是目前解析度最高的純RNA冷凍電鏡結構。該結構首次解析了外圍區域結構並揭示了其與核心區域P3-P9間幾個重要的長程相互作用。外圍區域P2、P2.1、P9.1、P9.2透過形成兩個假結結構（Pseudoknot）P13和P14，以及P14中的U43-A171-A172和P2-P2.1連線處的A31-U56-A95兩個鹼基三鏈體（Base triple），將P3-P9包圍起來。

（2）發現了兩種“始料未及”的長程相互作用。第一，P4螺旋中的核苷酸A210與P2中的A46之間形成氫鍵，並與P14中的G169形成一個鹼基堆疊（stacking），這樣的互作方式使三者之間形成一個“P2-P4-P14橋”的結構。之前的研究發現A210會降低四膜蟲核酶的結構穩定性，但對全長核酶的活性卻至關重要，這一長程相互作用為該結果做出了合理的解釋。第二，P9.1中富含嘌呤的內環（bulge）G358、A359、G360可以與催化核心P7間形成“P7多嘌呤長程相互作用”（P7 purine-rich interaction）以穩定酶活位點的結構。以上兩種結構發現展示了全新的外圍區域與核心區域間互作的方式，說明了外圍區域如何對酶活位點造成影響。

（3）透過比較核酶結合5’ 和3’ 外顯子底物的holo狀態與apo狀態的結構，揭示了透過互補配對結合底物的內部引導序列（Interna guide sequence，IGS）的構象重排，以及酶活位點的構象變化。與底物結合後，IGS區向催化核心的方向發生了約60°的構象旋轉，同時酶活位點中的鹼基和金屬離子也發生了一定程度的位移，雖然活性位點的大致結構在apo狀態下就已基本形成。

（4）在holo狀態的核酶中共鑑定出31個金屬離子（M1~M31）。有些金屬離子直接調控核酶的催化活性，其中包括先前透過生化功能實驗鑑定出直接參與酶活反應的MA（M26）和MC（M27）、遠端調控酶活的ME（M28）以及新發現的穩定酶活位點的M2。由於金屬離子，尤其是鎂離子，對RNA的正確摺疊以及功能活性都起到了至關重要的作用，所以該研究也揭示了運用冷凍電鏡研究RNA結構和功能的優勢。

綜上所述，該研究利用單顆粒冷凍電鏡技術揭示了四膜蟲核酶的全長高分辨三維結構，闡明瞭在底物結合和催化過程中IGS、金屬離子、磷酸基團與鹼基的構象變化，為長達40年來對四膜蟲核酶剪接反應的研究提供了結構和機制上的支援，同時也為後續進行高分辨RNA冷凍電鏡結構的研究提供了正規化。

四川大學華西醫院生物治療國家重點實驗室、華西醫院老年科與國家老年疾病臨床醫學研究中心為本研究的第一完成單位和通訊單位。蘇昭銘研究員為本研究第一和共同通訊作者，中國科技大學張凱銘研究員和斯坦福大學Kalli Kappel博士為共同一作。四川大學華西生物國重室冷凍電鏡中心工程師羅炳男參與了資料處理分析工作。同時，本研究得到了魏於全院士的大力支援。本研究由四川大學海外引進人才啟動經費和國家自然科學基金等專案資助完成。

四川大學華西生物國重室冷凍電鏡中心擁有300和200千伏前沿冷凍電鏡各一臺，同時配備了光電聯用（CLEM）系統，可以進行高分辨單顆粒重構、斷層成像（Cryo-ET）、微晶衍射（MicroED）等資料收集，現長期招聘具有一定電鏡操作經驗的工作人員；蘇昭銘課題組的研究興趣是運用冷凍電鏡揭示病原RNA和RNA蛋白複合物的結構和功能，並基於RNA結構設計和篩選RNA靶向小分子化合物，作為潛在的分子探針和候選藥物。

來源 | 四川大學華西醫院生物治療國家重點實驗室

編輯/稽核：Andy

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