01
研究背景
近年來，三種對人類具有高度致病性的冠狀病毒相繼出現：2002年的嚴重急性呼吸綜合徵冠狀病毒（SARS-CoV）、2012年的中東呼吸綜合徵冠狀病毒（MERS-CoV）以及2019年的SARS-CoV-2。SARS-CoV的平均病死率約為10%，而MERS-CoV則高達36%。截至目前，由SARS-CoV-2引發的COVID-19疫情已導致約700萬例確診死亡和約2800萬例估計死亡。至少10%的COVID-19患者會發展為“長新冠”，即初次感染後數月內症狀持續或出現新症狀。在SARS-CoV出現後，研究人員致力於開發冠狀病毒主蛋白酶（Mpro或3CLpro）的抑制劑，這為20年後快速開發具有廣譜冠狀病毒覆蓋的Mpro抑制劑nirmatrelvir奠定了基礎。若在COVID-19症狀出現五天內開始使用nirmatrelvir治療（與藥代動力學增強劑ritonavir聯合使用），可將死亡率和住院率降低約90%。此外，remdesivir和molnupiravir是核苷類似物的前藥，分別透過靶向病毒RNA依賴的RNA聚合酶（RdRp）和誘導錯誤災變發揮作用。這些藥物最初為治療其他病毒感染而開發，因其相對廣譜的抗病毒活性而被重新用於治療SARS-CoV-2感染。然而，由於藥物相互作用、靜脈注射需求或療效不佳，nirmatrelvir/ritonavir、remdesivir和molnupiravir的使用受到限制。
在COVID-19背景下，為應對新型高致病性冠狀病毒，識別冠狀病毒複製週期中的新抑制劑和新藥物靶點仍然至關重要。具有非重疊耐藥譜的抗病毒藥物非常適合開發（固定劑量）組合，以避免抗病毒藥物耐藥性的產生。除了基於靶點的藥物設計，表型抗病毒篩選能夠發現病毒複製週期中尚未被認為可成藥的其他靶點。透過篩選大型小分子庫，可以識別出抑制病毒複製且細胞毒性最小的化合物。一旦透過藥物化學改進了這些分子的效力和選擇性，便可揭示其分子機制，從而有可能識別出新的可成藥靶點。這一策略已成功識別出靶向丙型肝炎病毒NS5A蛋白的高效抑制劑，以及發現了一類高效的泛血清型登革病毒抑制劑。我們採用相同的策略（高通量篩選和命中最佳化）發現了CIM-834，這是一種口服有效的首創小分子裝配抑制劑，針對SARS-CoV-2和SARS-CoV的病毒M蛋白。M蛋白是病毒包膜中最豐富的結構蛋白，被認為是冠狀病毒裝配的主要驅動因素。
02
研究發現
研究團隊發現了一種名為CIM-834的小分子化合物，它能夠有效抑制SARS-CoV-2和SARS-CoV的組裝。CIM-834透過阻止冠狀病毒膜蛋白（M蛋白）從短形式（Mshort）向長形式（Mlong）的構象轉換，從而阻止病毒顆粒的組裝。該化合物在體外實驗中對多種SARS-CoV-2變體表現出強效的抗病毒活性，並且在感染SARS-CoV-2的SCID小鼠和敘利亞倉鼠模型中，口服給藥能夠顯著降低肺部病毒滴度。此外，CIM-834還能夠阻止感染倉鼠將病毒傳播給未感染的同伴。
透過單顆粒冷凍電子顯微鏡研究，CIM-834被發現能夠結合並穩定M蛋白的短形式，防止其向長形式的轉換，這是病毒顆粒成功組裝所必需的。該研究揭示了冠狀病毒複製週期中的一個新的可藥物靶點，即M蛋白，並展示了CIM-834作為一種有效的組裝抑制劑的潛力。CIM-834的發現為開發針對冠狀病毒的新型抗病毒藥物提供了重要的基礎。
03
臨床意義
CIM-834提供了一種新的、可靶向的抗病毒途徑，尤其是在現有治療方案（如蛋白酶和聚合酶抑制劑）效果有限或有耐藥性發展的情況下。這種新機制的抗病毒藥物不僅可以單獨使用，還可以與現有藥物聯合使用以提高治療效果並減少耐藥性的發展。該研究為未來冠狀病毒感染的治療提供了新的視角和潛在的治療選擇。
04
實驗策略
1. CIM-834提供了一種新的、可靶向的抗病毒途徑，尤其是在現有治療方案（如蛋白酶和聚合酶抑制劑）效果有限或有耐藥性發展的情況下。這種新機制的抗病毒藥物不僅可以單獨使用，還可以與現有藥物聯合使用以提高治療效果並減少耐藥性的發展。該研究為未來冠狀病毒感染的治療提供了新的視角和潛在的治療選擇。
2. 藥物化學最佳化：在篩選出CIM-834後，研究團隊透過結構優化合成了超過500種衍生物，最終確定CIM-834作為工具化合物用於機制研究和體內效力評估。
3. 體外抗病毒活性評估：使用VeroE6–GFP和A549ACE2+TMPRSS2細胞系評估CIM-834的抗病毒活性，結果顯示其對多種SARS-CoV-2變種和SARS-CoV具有顯著的抑制作用，其EC50值與已知的抗病毒藥物如nirmatrelvir相當。
4. 體內實驗：在SCID小鼠和敘利亞倉鼠中進行實驗，口服CIM-834顯著降低了肺部病毒滴度，並在感染倉鼠中阻止了病毒傳播。
5. 電子顯微鏡和冷凍電鏡研究：透過電子顯微鏡觀察到經CIM-834處理的細胞中病毒顆粒組裝完全缺失。冷凍電鏡揭示CIM-834能結合並穩定M蛋白的短形式，從而阻止其轉化為長形式，這對於病毒顆粒的成功組裝是必需的。
05
資料解讀
圖1：CIM-834抑制SARS-CoV-2和SARS-CoV的複製
Figure 1 研究了CIM-834對SARS-CoV-2和SARS-CoV病毒複製的抑制作用。 A. 圖A展示了CIM-834的結構式。 B. 為了評估CIM-834對不同SARS-CoV-2變體和SARS-CoV的抑制效果，研究者在兩種不同的細胞系中進行了實驗，並將結果與Nirmatrelvir和GS-441524進行了對比。結果顯示，CIM-834在這兩種細胞系中均有效抑制病毒複製。箱線圖展示了中位數、25%和75%分位數，須線表示最大值和最小值，X軸上方標註了獨立生物實驗的次數。 C. 透過劑量反應曲線分析了CIM-834在A549ACE2+TMPRSS2細胞上的抗病毒活性（彩色線）和細胞毒性（虛線），結果表明CIM-834具有顯著的抗病毒活性，且細胞毒性較低。該實驗進行了4次獨立生物實驗，結果以平均值±標準誤表示。 D-F. 為了驗證CIM-834對SARS-CoV-2 B.1.1.7變體的抑制效果，研究者在氣-液介面培養的原代人鼻細胞中進行了實驗。結果顯示，經過CIM-834處理後，第2天（圖E）和第4天（圖F）的病毒RNA水平顯著降低。實驗結果透過Kruskal–Wallis檢驗和Dunn’s比較分析，顯示統計學顯著性，實驗進行了6次獨立生物實驗，結果以平均值±標準誤表示。 結論：CIM-834能夠有效抑制SARS-CoV-2和SARS-CoV的複製，並在多種細胞系和原代人鼻細胞中顯示出顯著的抗病毒活性。
圖2：CIM-834在SARS-CoV-2感染的SCID小鼠和倉鼠中的療效
Figure 2 研究了CIM-834在SARS-CoV-2感染的SCID小鼠和倉鼠中的抗病毒效果。 a. 為了評估CIM-834在SARS-CoV-2感染中的療效，作者將SCID小鼠鼻腔內感染SARS-CoV-2 B.1.351，並分別給予CIM-834或nirmatrelvir治療，每天兩次。治療在感染前（第0天）或感染後指定時間開始。結果顯示，CIM-834在感染前或感染後給藥均能有效抑制病毒。 b, c. 透過檢測感染後3天的小鼠肺部感染滴度和病毒RNA負荷，結果顯示，CIM-834治療組的肺部感染滴度和病毒RNA負荷顯著低於對照組，表明CIM-834具有良好的抗病毒效果。 d. 在感染後第3天，作者測量了不同治療組小鼠的體重變化，結果顯示，CIM-834治療組的小鼠體重變化較小，表明CIM-834能夠減輕病毒感染引起的體重下降。 e. 為了進一步驗證CIM-834的療效，作者將敘利亞倉鼠鼻腔內感染SARS-CoV-2 USA-WA1/2020，並連續四天給予CIM-834/ritonavir或nirmatrelvir治療。感染後一天，治療後的倉鼠與未治療的哨兵倉鼠共同飼養。 f. 在感染後第4天，作者檢測了倉鼠的肺部感染滴度、病毒RNA負荷和病理評分，結果顯示，CIM-834治療組的肺部感染滴度和病毒RNA負荷顯著降低，病理評分也有所改善。 g. 在共同飼養開始三天後，作者檢測了未治療的哨兵倉鼠的肺部感染滴度和病毒RNA負荷，結果顯示，與CIM-834治療組共同飼養的哨兵倉鼠的感染滴度和病毒RNA負荷顯著降低。 h. 透過蘇木精和伊紅染色觀察感染後第4天倉鼠肺部的病理變化，結果顯示，CIM-834治療組的肺部炎症和支氣管肺炎程度較輕，而對照組則出現明顯的支氣管和血管區域炎症，以及支氣管肺炎。 結論：CIM-834在SARS-CoV-2感染的SCID小鼠和倉鼠中顯示出良好的抗病毒效果，能夠有效降低病毒負荷和改善病理變化。
圖3：M蛋白中的氨基酸替換P132S被CIM-834選擇並與抗病毒耐藥性相關
Figure 3 研究了SARS-CoV-2病毒在抗病毒藥物CIM-834的選擇壓力下產生的M蛋白氨基酸替換P132S，以及該替換與抗病毒耐藥性的關係。 A. 為了研究SARS-CoV-2對CIM-834的耐藥性，作者在A549ACE2+TMPRSS2細胞中，透過逐步增加CIM-834濃度傳代SARS-CoV-2 B.1.1.7變異株，進行體外耐藥性選擇實驗。 B. P132S替換位於M蛋白的羧基末端病毒內域，表明該位置的氨基酸變化可能影響病毒的結構或功能。 C. 透過反向遺傳學方法，將M(P132S)引入SARS-CoV-2武漢株和Omicron BF.7株的背景中，以研究該突變的影響。 D. 在空氣-液體介面培養的人鼻上皮氣道細胞中，檢測rWuhan-WT和M(P132S)突變體的複製動力學。透過不同時間點收集的頂端洗液測定傳染性病毒滴度，結果顯示M(P132S)突變體的複製能力與野生型相比有變化。 E. 在A549ACE2+TMPRSS2細胞中，檢測rWuhan-WT和M(P132S)對CIM-834及參考抑制劑GS-441524和nirmatrelvir的敏感性。透過兩因素方差分析（ANOVA）和Sidak多重比較檢驗比較EC50值，結果顯示M(P132S)突變體對CIM-834的敏感性降低。 F. 研究其他M蛋白替換與化合物耐藥性的關係，這些突變在Omicron BF.7背景中透過反向工程實現。透過兩因素ANOVA和Dunnett多重比較檢驗比較EC50值，結果顯示不同突變體的耐藥水平不同。 G. 比較M突變體與野生型病毒的EC50值變化倍數（與圖F相同的資料），結果顯示P132S突變體的EC50值顯著增加，表明其耐藥性增強。 結論：M蛋白中的P132S氨基酸替換在CIM-834的選擇壓力下被選擇，並與抗病毒藥物的耐藥性相關。
圖4：CIM-834抑制SARS-CoV-2組裝
Figure 4 探討了CIM-834對SARS-CoV-2病毒組裝的抑制作用，透過多種實驗方法驗證了CIM-834對病毒結構蛋白M的影響。 A. 實驗設計展示了VLPs（病毒樣顆粒）實驗的設定，目的是研究CIM-834對SARS-CoV-2組裝的影響。 B-C. 透過免疫印跡實驗，作者對野生型M蛋白和M(P132S)突變體的寡聚體與總蛋白的比值進行了定量分析。結果顯示，與DMSO對照組相比，CIM-834處理組的M蛋白寡聚體形成顯著減少。 D. 代表性的免疫印跡結果展示了M蛋白的表達情況，以微管蛋白作為裝載對照。 E-F. 透過免疫印跡檢測細胞外M單體的分泌量，計算M在培養基和細胞裂解液中的比例。結果表明，與DMSO對照組相比，CIM-834處理組的野生型M蛋白和M(P132S)突變體的分泌量顯著降低。 G. 透過電子顯微鏡觀察，在感染SARS-CoV-2後10小時，DMSO和CIM-834處理細胞的核周區域。結果顯示，CIM-834處理組的病毒和病毒組裝位點減少，膜結構擴充套件。 H. 斷層掃描重建結果顯示，CIM-834處理組中成熟和組裝中的病毒顆粒減少，膜曲率和內陷區域減少。 I. 定量分析顯示，每1平方微米細胞質區域的雙膜囊泡（DMVs）數量、顯示（組裝中）病毒顆粒的細胞百分比以及具有DMV鄰近膜堆積的細胞百分比在CIM-834處理組中顯著降低。 J. 提出的CIM-834抗病毒機制：CIM-834透過與M短結合，阻止其構象轉換，從而抑制病毒組裝。 結論：CIM-834透過抑制M蛋白的構象轉換，顯著抑制了SARS-CoV-2的組裝和釋放。
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主要結論
這篇論文介紹了一種新型冠狀病毒裝配抑制劑CIM-834，它透過靶向冠狀病毒膜蛋白(M)來阻止SARS-CoV-2的裝配。透過高通量篩選和藥物化學最佳化獲得的CIM-834，能夠有效抑制SARS-CoV-2和SARS-CoV的複製。在SCID小鼠和敘利亞倉鼠模型中，口服CIM-834治療顯著降低了肺部病毒滴度，並阻止了病毒的傳播。研究表明，CIM-834透過結合並穩定M蛋白的短形式，阻止其轉變為長形式，從而抑制病毒顆粒的裝配。這表明M蛋白和冠狀病毒的裝配過程是潛在的藥物靶點。
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討論總結
研究指出冠狀病毒複製週期中有許多潛在的藥物靶點，而M蛋白就是其中之一。CIM-834透過阻止M蛋白的構象轉換來抑制病毒的裝配，同時不影響病毒RNA的複製。實驗表明，儘管CIM-834不影響vRNA的水平，但它能夠顯著降低傳染性病毒的滴度。此外，CIM-834可以與現有的蛋白酶和聚合酶抑制劑進行聯合治療，以預防抗藥性的產生。作者認為CIM-834所在的M靶向分子類別具有進一步最佳化的潛力，可能擴充套件其抗病毒譜，包括MERS-CoV等其他冠狀病毒。該研究強調了基於高通量表型抗病毒篩選的藥物和靶點發現的價值。
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