01
研究背景
抗生素耐藥性是全球面臨的重大危機，2019年因耐藥性導致的死亡人數超過450萬，嚴重威脅到我們有效治療細菌感染的能力。因此，發現新的抗菌化合物，尤其是針對被世界衛生組織列為關鍵威脅的革蘭氏陰性菌的化合物，成為當務之急。多種微生物產生的基於肽的抗生素，如糖肽類（如萬古黴素）、陽離子肽（如多粘菌素）和β-內醯胺類（如青黴素和頭孢菌素）已成功用於治療由細菌病原體引起的疾病。大多數醫學上相關的肽類抗生素是透過非核糖體途徑合成的，涉及抗生素產生菌和真菌基因組中編碼的專門肽合成酶裝配線。
核糖體合成並經過翻譯後修飾的肽（RiPPs）是快速擴充套件的一類抗生素。這些具有生物活性的天然產物透過核糖體翻譯編碼肽基因，並透過專門的酶對前體肽進行後續加工，引入多種翻譯後修飾，包括分子內環化、脫水和雜環形成。這些修飾設定了肽的三維形狀，促進其與靶標的相互作用，並保護其免受細胞肽酶的降解。套索肽是RiPPs的一種，具有獨特的三維形狀，其C端尾部穿過由N端骨架氨基和內部Asp或Glu殘基側鏈羧基形成的異肽鍵構成的分子內環。結果是一個高度穩定的空間打結結構，使這一類肽得名。已知的幾種套索肽具有抗菌特性。例如，lassomycin靶向微生物ClpP蛋白酶並表現出抗分枝桿菌活性，而microcin J25和capistruin對革蘭氏陰性菌有效，能阻止RNA聚合酶的作用。然而，尚無套索肽被證明可作用於核糖體。
02
研究發現
研究團隊發現了一種新型的lasso肽類抗生素，名為lariocidin（LAR），及其衍生物lariocidin B（LAR-B），由Paenibacillus sp. M2菌株產生。這些化合物具有廣譜抗菌活性，能夠透過結合細菌核糖體並干擾蛋白質合成來抑制細菌生長。結構和生化分析表明，lariocidins結合在小核糖體亞基的一個獨特位點，與16S核糖體RNA和氨醯-tRNA相互作用，從而抑制轉位並引發錯誤編碼。LAR對常見的抗性機制不敏感，生成自發抗性的可能性低，對人類細胞無毒性，並在小鼠鮑曼不動桿菌感染模型中顯示出強效的體內活性。
LAR的發現揭示了以核糖體為靶點的lasso肽的新途徑，為開發急需的抗菌藥物提供了新的化學結構框架。LAR透過限制30S亞基的結構重排來抑制EF-G催化的轉位，並透過與氨醯-tRNA的相互作用可能導致錯誤編碼。由於其獨特的結構和結合模式，LAR對導致其他核糖體靶向抗生素高水平抗性的突變或酶抗性機制不敏感。LAR在營養限制條件下表現出顯著的活性改善，表明其在體內條件下的潛在應用價值。
03
臨床意義
新型抗菌機制：Lariocidin透過獨特的方式與核糖體小亞基的16S rRNA及氨醯tRNA結合，抑制蛋白質合成中的轉位步驟並引發錯譯。這種作用機制不同於目前已知的抗生素作用方式，為開發新型抗生素提供了新的靶點。 廣譜抗菌活性：Lariocidin針對多種革蘭氏陽性和陰性細菌，包括對多藥耐藥的臨床病原體如鮑曼不動桿菌表現出顯著的抗菌活性，尤其在營養限制的環境中效果更佳。這表明LAR在治療複雜細菌感染時具有潛在應用價值。 低耐藥性傾向：Lariocidin不易產生自發耐藥性，並且不受常見的耐藥機制影響。這一特性對於抗擊抗生素耐藥性危機至關重要，有望延長抗生素的臨床有效期。 低毒性：研究顯示Lariocidin對人類細胞無毒性，這為其作為安全的治療選擇奠定了基礎。 動物模型驗證：在小鼠感染模型中，Lariocidin展示了對多藥耐藥鮑曼不動桿菌的強效體內活性，顯著減少了細菌負擔並提高了生存率，支援其作為潛在臨床抗生素的開發。 總之，Lariocidin的發現不僅為抗生素開發提供了新的化學骨架，還展示了其在抗擊嚴重細菌感染中的潛力，可為解決抗生素耐藥性危機提供新的解決方案。
04
實驗策略
1. 篩選與鑑定：研究人員透過長時間培養環境細菌菌株，篩選出具有抗菌活性的菌株Paenibacillus sp. M2。透過基因組測序和生物活性引導的純化，識別出LAR為活性化合物。
2. 結構與功能研究：透過結構、遺傳和生化分析，證明LAR透過與細菌核糖體結合來抑制蛋白質合成，具體透過與16S rRNA和氨醯-tRNA相互作用，阻礙轉位並誘導誤碼。
3. 抗性機制與靶點分析：透過選擇自發性耐藥突變體和全基因組測序，發現LAR的抗性突變主要位於16S rRNA的h31和h34螺旋，這些發現定位了LAR在核糖體上的新結合位點。
4. 體外和體內活性測試：LAR在小鼠鮑曼不動桿菌感染模型中表現出強效的體內活性，並且顯示出對人類細胞無毒性。
5. 異源表達：透過在Streptomyces lividans中異源表達LAR的生物合成基因簇（BGC），驗證了該基因簇包含合成和分泌LAR所需的全部基因。
6. 結構解析：透過X射線晶體學，解析了LAR和LAR-B與核糖體的結合結構，揭示了其獨特的結合模式和作用機制。
05
資料解讀
圖1：LAR及其生物合成基因簇
Figure 1 展示了LAR及其變體的生物合成過程和異源表達分析，重點在於LAR生物合成基因簇（BGC）的組成及其在異源宿主中的表達。 a. 為了揭示LAR的生物合成機制，作者分析了lrc BGC的基因組成及其後翻譯修飾過程。LrcA前體肽經過LrcB1和LrcB2識別並切割引導肽，隨後LrcC進行環化，LrcF切割末端甘氨酸生成LAR-B和LAR-C變體。目前尚不清楚LAR-B的第二個異肽鍵是如何形成的。 b. 為了分析LAR在異源宿主中的表達，作者在S. lividans中異源表達lrc BGC，並透過陽離子交換色譜分析細胞遊離上清液中的LAR。圖中顯示的色譜分析結果表明，約12.5分鐘的主要峰對應於LAR，經質譜確認。SL-Lrc為轉化了pIJ10257-lrc的S. lividans；M2對照為從原始生產者Paenibacillus M2中純化的LAR；SL-對照為轉化了空載體的S. lividans。 c. 為了確認LAR的不同變體，作者透過液相色譜-質譜（LC-MS）分析從異源宿主中純化的LAR，結果顯示生成了三種異構體：LAR（m/z = 936.039）、LAR-B（m/z = 898.523）和LAR-C（m/z = 907.528）。所有顯示的質量為[M + 2H]2+離子。 d. 為了探討LrcF在LAR變體生物合成中的作用，作者分析了在lrc operon中刪除lrcF基因的異源宿主中產生的LAR。LC-MS分析顯示，僅生成LAR，而不生成LAR-B和LAR-C變體，這表明LrcF在這些變體的生物合成中起作用。 結論：LAR的生物合成涉及多個基因和蛋白質的協同作用，LrcF在LAR-B和LAR-C變體的生成中起關鍵作用。透過異源表達和質譜分析，明確了LAR及其變體的生成過程。
圖2：LAR表現出殺菌活性並靶向細菌蛋白質合成
Figure 2 研究了LAR對細菌的殺菌活性及其對細菌蛋白質合成的影響。 A. 為了評估LAR對細菌的殺菌活性，作者對大腸桿菌培養物進行了處理，使用LAR（10倍最低抑菌濃度，40 μg/ml）或細胞膜靶向裂解抗生素多粘菌素（10倍最低抑菌濃度，5 μg/ml），透過菌落形成單位（cfu）的減少來測量。結果顯示，LAR顯著減少了大腸桿菌的菌落形成單位。 B. 為了研究LAR對大腸桿菌指數期培養物密度的影響，作者使用LAR或多粘菌素進行處理。結果表明，LAR和多粘菌素均降低了大腸桿菌的培養密度。 C. 透過碘化丙啶（PI）積累實驗評估LAR對細胞通透性的影響。實驗中，Y軸代表相對熒光單位（RFU），並以時間0的初始熒光進行標準化。結果顯示，LAR增加了細胞通透性，多粘菌素作為陽性對照。 D. LAR-BODIPY在大腸桿菌細胞的細胞質中被發現。綠色代表LAR-BODIPY熒光，紅色為膜染料FM4-64，藍色為DNA染料Hoechst 33342。影像代表了三次實驗的結果。 E-F. 為了研究LAR對蛋白質合成的影響，作者在無細胞轉錄-翻譯系統中使用編碼螢火蟲熒光素酶（Luc）或GFP的質粒進行實驗。結果顯示，LAR抑制了蛋白質合成。 G. 在兔視網膜溶解物中，使用luc mRNA程式設計，研究LAR對蛋白質合成的影響。結果表明，LAR抑制了蛋白質合成。 H. 透過轉位抑制實驗，研究LAR對mRNA-tRNA複合物透過核糖體運動的干擾。結果顯示，LAR和已知的轉位抑制劑negamycin（NEG）均干擾了mRNA-tRNA複合物的轉位。 I. 透過趾印分析，研究LAR對核糖體在模型mRNA上的停滯。翻譯起始抑制劑retapamulin（RET）作為對照。結果顯示，LAR導致核糖體在起始密碼子和內部密碼子處停滯。 J. LAR誘導錯誤編碼，表現為攜帶提前終止密碼子的lacZ基因的大腸桿菌細胞能夠產生功能性β-半乳糖苷酶（視覺化為生長抑制區邊緣的藍色光暈）。誘導錯誤編碼的慶大黴素（GEN）和鏈黴素（STR）作為陽性對照，氯黴素（CHL）作為陰性對照。 結論：LAR具有顯著的殺菌活性，並透過干擾細菌蛋白質合成的多種機制來實現這一效果。
圖3：與核糖體結合的LAR和LAR-B的結構及電子密度圖
Figure 3 展示了LAR和其異構體LAR-B與核糖體結合的結構細節。 圖3a和3c提供了LAR和LAR-B的示意性結構圖。圖中標記了N-端前7個氨基酸（黃色）、分支點（紅色，第8位氨基酸）以及C-末端殘基9到18（藍色）。LAR-B中形成第二個異肽鍵的Lys2的顏色為橙色。 圖3b和3d顯示了分別與菌核糖體形成複合物的LAR和LAR-B的2Fo−Fc傅立葉電子密度圖，電子密度圖用藍色網格表示。LAR及其異構體的精煉模型顯示在其各自的電子密度圖中，輪廓線為1.0σ。 透過這些影像，研究人員可以準確地觀察到LAR和LAR-B與細菌核糖體相互作用的模式，尤其是如何嵌入到小核糖體亞單位中的。這些細節證實了LAR類套索肽與核糖體結合的獨特方式，為進一步開發此類抗菌藥物提供了分子基礎。研究還指出，LAR-B由於其特有的第二個異肽鍵形成了雙套索結構，可能具有更高的熱力學和代謝穩定性，對未來的藥物開發提供了重要線索。
圖4：LAR與溫泉菌70S核糖體複合物的結構
Figure 4 詳細展示了LAR（lariocidin）在細菌核糖體小亞單位上的結合位點和結合方式，以及與核糖體和轉運RNA（tRNA）的相互作用。 圖4a和4b給出了LAR在細菌核糖體上結合位點的概覽，從不同的視角展示了它與核糖體小（30S）和大亞單位（50S）、信使RNA（mRNA）、以及A、P、E位tRNA的關係。LAR的結合位置緊鄰解碼中心。 圖4c詳細展示了LAR如何與小核糖體亞單位相互作用。LAR與16S rRNA的h31、h32和h34螺旋之間形成多種接觸。其芳香側鏈Phe11透過π–π堆積與U531鹼基形成相互作用。 圖4d與圖4c類似，但重點強調了LAR與mRNA鹼基之間的相互作用，雖然主要是與16S rRNA的磷酸糖骨架接觸，而非直接與鹼基相互作用。這種互動模式解釋了LAR抗性突變對其最小抑菌濃度（MIC）影響較小。 圖4e和4f展示了以小核糖體亞單位解碼中心為目標的幾種抗生素（如odilorhabdin、四環素、奈替米星、鏈黴素和巴龍黴素）的結合位點與LAR的結合位點的對比。LAR的結合位點與這些抗生素明顯不同，僅有odilorhabdin部分重疊。 透過這些結構研究，可以看出LAR具有獨特的結合模式，與現有的其他小核糖體亞單位靶向抗生素有顯著不同。這一點使得LAR在潛在的臨床應用中可能具有新的優勢，尤其是在對抗耐藥性菌株時。
圖5：LAR在小鼠中性粒細胞減少性大腿感染模型中的治療效果
Figure 5 為了評估LAR在小鼠中性粒細胞減少性大腿感染模型中的治療效果，研究人員對感染鮑曼不動桿菌C0286的小鼠進行了LAR治療，並觀察其對細菌負擔和存活率的影響。 A. 為了評估LAR對脾臟細菌負擔的影響，研究人員在感染後1小時、4小時、8小時和20小時透過腹腔注射給予小鼠50 mg/kg的LAR。結果顯示，與對照組（n=21）相比，LAR治療組（n=15）在感染後24小時和48小時脾臟中的細菌負擔顯著降低。 B. 為了評估LAR對大腿部位細菌負擔的影響，研究人員在相同的時間點和劑量下給予LAR。結果表明，與對照組（n=32）相比，LAR治療組（n=30）在感染後24小時和48小時大腿部位的細菌負擔顯著降低。 C. 為了評估LAR對血液細菌負擔的影響，研究人員在相同的時間點和劑量下給予LAR。結果顯示，與對照組（n=10）相比，LAR治療組（n=8）在感染後24小時和48小時血液中的細菌負擔顯著降低。 D. 為了評估LAR對小鼠存活率的影響，研究人員使用Kaplan-Meier生存分析法比較了LAR治療組和對照組在感染過程中的存活情況。結果表明，LAR治療組（n=8）在感染後存活率顯著高於對照組（n=10）。 結論：LAR在小鼠中性粒細胞減少性大腿感染模型中顯著降低了細菌負擔，並提高了小鼠的存活率，顯示出其良好的治療效果。
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主要結論
這項研究揭示了由Paenibacillus sp. M2菌株產生的lasso肽抗生素lariocidin及其衍生物lariocidin B。這些化合物對多種細菌病原體具有廣譜活性。研究表明，lariocidins透過與核糖體結合並干擾蛋白質合成來抑制細菌生長。具體而言，lariocidins結合在小核糖體亞基的一個獨特位點，與16S核糖體RNA和氨醯-tRNA相互作用，從而抑制轉位並引發錯誤編碼。Lariocidin不受常見的耐藥機制影響，產生自發性耐藥的可能性較低，對人類細胞無毒性，並在小鼠鮑曼不動桿菌感染模型中表現出強效的體內活性。這一發現為開發新的蛋白質合成抑制劑提供了新的途徑，併為開發急需的抗菌藥物提供了新的化學骨架。
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討論總結
在抗菌藥物耐藥性危機的背景下，研究新型抗菌化合物是當務之急。研究表明，lariocidin是一種獨特的lasso肽，它透過結合核糖體並干擾蛋白質合成來抑制細菌生長，同時引發錯誤編碼。其特殊的結合位點使其對現有核糖體靶向抗生素的耐藥性交叉較少。此外，lariocidin的結構穩定性和廣譜活性使其成為一種有前途的抗菌藥物候選者。研究還強調了其在營養限制條件下的增強活性，提示在體內環境中具有更好的藥效表現。透過在異源宿主中表達，並結合結構和功能分析，為進一步最佳化lariocidin及其類似物提供了基礎，從而為解決抗生素耐藥性危機提供新的希望。
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