“我們首次在接近生理濃度（毫摩爾級別）的鎂離子環境下，直接觀察到 RNA 分子的動態行為，完全顛覆了對 RNA 的傳統認知。”美國國家癌症研究所王運星教授表示。
他所提到的，是其團隊近期在 Nature 同一期連續發表兩篇“背靠背”論文中的研究結果 [1-2]。他們開發了一種解析單個分子核糖核酸（RNA，RibonucleicAcid）三維結構的新方法 HORNET，該方法結合了深度神經網路和 RNA 在溶液中的原子力顯微鏡成像。
值得關注的是，這是絕對意義上的單分子結構三維結構，無需對多個分子的訊號進行疊加進而增強信噪比。因此，該方法非常適用於檢測大型 RNA 分子在溶液中的不同構象狀態。
審稿人對該研究評價稱，這是 RNA 研究領域的重大突破，無論是在技術開發方面，還是對 RNA 摺疊與動態性的根本性概念方面，都具有重要意義。
圖丨論文通訊作者王運星（來源：資料圖）
HORNET 方法在 RNA 藥物開發中具有潛在應用價值，例如最佳化 RNA 藥物設計和提高藥物研發效率等。該研究有望突破當前 RNA 藥物研發的瓶頸，顯著拓寬 RNA 藥物的研發範圍。此外，其還可用於研究基礎生物學研究、RNA 摺疊機制探索以及 RNA 介導的基因調控等。
重新整理傳統認知：更正過去 60 多年關於 RNA 結構觀念的誤導
過去，人們普遍認為一條蛋白質初級序列只能摺疊成單一（即“一對一”）或極少數的三維結構。經過 60 多年的發展，人們能夠基於蛋白質初級序列，利用 AI 輔助演算法和結構資料庫預測其三維結構，並設計出自然界中不存在的全新蛋白質。2024 年，諾貝爾化學獎授予了計算蛋白質設計和基於 AI 的蛋白質結構預測。
然而，RNA 結構生物學領域並未取得類似蛋白質結構生物學的成功。實驗解析 RNA 結構的關鍵挑戰在於，研究方向往往聚焦在探索完美的溶液條件，使 RNA 分子摺疊成便於用現成的工具和方法來解析結構。
這在很大程度上受到了過去 60 多年關於 RNA 結構的錯誤觀念的影響。王運星實驗室的研究結果顛覆和更正了這些觀念，並提出了用“準等能量”分子構象轉換概念，來概括全新的 RNA 分子在溶液中的行為。
實際上，RNA 分子的靈活性和異質性對其生理功能和活性至關重要，單一的 RNA 初級序列能夠形成多種甚至無數種三維結構或構象，但這一假想從未得到直接實驗上的證實。
鎂離子對 RNA 的摺疊起到非常關鍵的作用，而結構資料庫中記錄的 RNA 結構大多是在極端溶液條件下（高濃度鎂離子）測定的，而非生理條件下的真實情況。
傳統的間接方法，例如核磁共振、X 射線晶體學和冷凍電鏡在生理相關的鎂離子濃度下，無法解析具有高度異質性構象的 RNA 三維結構，尤其在每個單分子的結構和構象彼此顯著不同的生理條件下會失效。因此，要實現 RNA 在生理條件下的真實結構解析，需要發展新的概念和技術。
“眼見為實”：直接觀察到 RNA 單個構象體三維結構
2013 年，該團隊透過小角 X 射線散射技術，首次揭示了 HIV-1 RRE RNA 在溶液中呈現“A”形構象。然而，由於這是一種間接的方法，無法得出更真實的結論。於是，他們開始使用原子力顯微鏡影像，可以大致看出三角形的影像。後來，隨著技術的進步，課題組成員開始進一步處理這些影像。
2020 年年初，他們得到的影像已經能夠清晰地顯示出“A”的形狀，但由於原子力顯微鏡的解析度限制（約 11-12Å），仍然無法確定從影像中得出結構的準確結構。2023 年，王運星實驗室首次透過直接的顯微鏡觀察影像展示了 RNA 結構的不同構象 [3]。
在該研究中，研究人員採用原子力顯微鏡直接觀察到 RNA 單個構象體大致三維結構，無需透過訊號平均增強訊號來獲取結構。為克服原子力顯微鏡解析度低的瓶頸，研究人員透過機器學習、神經網路以及一種新的準結構資料庫，來估算確定結構的準確性。
他們生成了一個覆蓋 RNA 全構象空間的大型準結構資料庫，透過用準結構資料庫以及來自不同來源、尺寸和形狀的 RNA 分子對神經網路演算法進行訓練，並用其來估算由原子力顯微鏡影像確定的未知結構模型的準確性。
圖丨直接觀察溶液中的 RNA 分子，不同的顏色和形狀表示具有相同主序列的 RNA 分子的異質性構象（來源：資料圖）
王運星指出，在透過大規模溶液動力學計算得到可能的結構模型後，用 HORNET 確定 RNA 結構模型的準確性非常高效，僅需約 5-30 分鐘即可完成（注：整個過程，包括前期大規模模型計算需要約一個星期時間）。
HORNET 能夠在溶液中對靈活分子的單個 RNA 構象體結構進行解析，其解析度優於 5Å，這對於靈活分子而言非常有意義。
圖丨 HORNET 的整體工作流程（來源：Nature）
“我們的研究結果是直接觀察到的現象，而不是基於間接方法的推斷。除了技術上的突破，還完全顛覆了過去的 60 多年以來關於 RNA 初級順序和三維結構關係問題的基本概念。”王運星說。
需要了解的是，RNA 的核心不在於單一高解析度結構，因為在溶液中 RNA 非常動態且靈活並隨時間變化，無法僅透過在某一時間單一或少量高解析度結構來真實表徵。因此，表徵 RNA 結構和動態特性的適當方式應是確定構象體集合的三維拓撲結構。
研究人員利用 6 個基準案例對 HORNET 的實用性進行了驗證，且以 RNase P RNA 和 HIV-1 RRE RNA 兩個例項作為解析，展示了分子在溶液中的構象異質性。
圖丨從原子力顯微鏡影像中提取的 RNA 結構（來源：Nature）
近日，相關論文發表在 Nature，題目為《利用原子力顯微鏡和深度神經網路確定 RNA 構象的結構》（Determining structures of RNA conformers using AFM and deep neural networks）[1]。
美國國家癌症研究所博士後瑪克西米莉婭·F·S·德根哈特（Maximilia F. S.Degenhardt）是第一作者，王運星教授為通訊作者。
圖丨相關論文（來源：Nature）
為藥物設計提供完整的結構動力學基礎
基於 HORNET 方法，該課題組首次在接近生理條件下，繪製 RNA 的完整結構和構象空間，並揭示了 RNA 在溶液中全新行為。
研究人員發現，RNA 的不同三維構象之間可以相互轉化，並且這種轉變幾乎是零能量的（準等能量變化）。這一發現打破了學術界和這一領域裡的傳統的認知。他們解析了 158 個 RNA 結構，再次證明同一個初級序列可以摺疊出多種不同的結構。
該團隊展示了 RNase P RNA（注：RNase P 酶是細胞裡最基本且極為重要的酶之一，而 RNA 是其催化機理的核心）在生理條件下溶液中的構象異質性。
研究發現，RNase P RNA 涵蓋了高度靈活的外圍結構片段，並且發現此 RNA 中存在一個構象不變的核心。這些結構片段在多個方向上以 20–60Å 的幅度廣泛地探索構象空間，且幾乎不消耗能量，而此構象不變的核心的結構卻保持同一結構。
圖丨溶液中單個 Gst RNase P RNA 分子的原子力顯微鏡影像（來源：Nature）
此外，相關分析表明，RNA 的初級序列決定了關鍵區域的結構和動態功能。這些發現揭示了 RNase P RNA 在保持酶促精確性與底物多樣性方面的結構-動態基礎。
近日，相關論文發表在 Nature，題目為《溶液中 RNase P RNA 的構象空間》（The conformational space of RNase P RNA in solution）[2]。
美國國家癌症研究所博士後李雲彩（Yun-Tzai Lee）和瑪克西米莉婭·F·S·德根哈特是共同第一作者，王運星教授為通訊作者。
圖丨相關論文（來源：Nature）
總體來看，HORNET 方法實現了在溶液條件下，對單分子 RNA 多構象的直接視覺化和結構解析。這種方法能夠提供完整的 RNA 構象空間和動態性資訊，明確指出哪些結構區域是柔性的，哪些是固定的，從而為靶向藥物設計提供更精準的資訊。
該研究首次確定了靈活 RNA 中的不變區域（invariable region，即“構象不變的核心”），這些區域對藥物設計開發的確定精確關鍵靶點和結構基礎研究具有重要意義，HORNET 確定的不變區域能夠指導靶向藥物設計，並提高設計準確性和成功率。
截至目前，美國食品藥品監督管理局（FDA，Food and Drug Administration）僅批准了一種 RNA 靶向藥物（Risdiplam，用於治療脊髓性肌肉萎縮症），其他針對 RNA 的化合物失敗的部分原因之一在於缺乏對構象空間的完整和準確的資訊和描繪，且藥物設計是基於在非生理高鎂離子濃度下獲得的靜態結構，和實際情況大相庭徑。
這項研究更新了人們對 RNA 序列、三維結構和功能關係的傳統認識。其標誌著結構生物學從解析靜態結構的“快照”，朝向獲取分子動態結構“電影”研究方向的轉變。
“在此之前，沒有其他方法能夠僅基於單個分子的實驗資訊確定任何單個分子或構象體的結構，以及獲得關於 RNA 分子完全構象空間，HORNET 方法首次實現了這一目標。”王運星表示。
相較於傳統方法，HORNET 方法的儀器成本相對較低。該研究解決了在溶液中解析 RNA 異質結構的挑戰，有望對 RNA 結構生物學的基礎研究產生深遠影響。
該方法還為研究長鏈 RNA（如長非編碼 RNA，lncRNA 使用）提供了新途徑。要知道人類基因組中編碼蛋白質的部分不到 3%，而超過 80% 的人類基因組會被轉錄為 RNA，它們在生物系統中扮演重要角色，但其結構和動態特性難以透過傳統方法進行研究。
透過完整的構象空間對映，HORNET 方法能夠提供 RNA 結構動態性的資訊，有助於設計更穩定和特異性更高的藥物。基於以上原理，研究人員還設計了一系列多肽分子，這些多肽對 HIV-1 RRE RNA 的結合力甚至高於自然的 Rev 蛋白。
選擇“少有人走”之路：追求科學上的原創性和根本性突破
這項研究的起源可追溯到 30 年前，王運星教授在研究生時期提出的 RNA 構象異質性假說。當時，他透過核磁共振技術研究 RNA 的光譜線寬問題，推測到其異質性。
在過去的 20 多年中，王運星始終追求科學上的原創性和根本性突破。“我認為應該多提出創新想法，即便是教科書中和普遍接受的認知也未必一定是正確的，應該把重點放在探索和更新知識。”王運星說。
正是堅持了這種科研精神，他帶領團隊開發了一系列新方法和新技術，來應對研究 RNA 結構和動力學的挑戰：從創新性地利用小角 X 射線散射描繪 HIV RNA 的重要分子拓撲結構，為 RNA 結構研究提供新的維度；到世界首個 RNA 標記技術與 RNA 精確標記裝置，大幅提高了 RNA 研究的精度和效率；再到全球首次使用 X 射線自由電子雷射捕獲 RNA 中間態結構，為研究 RNA 的動態過程開闢了新途徑。
王運星指出，這些成果不僅鞏固了 RNA 異質性研究的基礎，還為藥物開發、基因治療及 RNA 裝置的未來應用奠定了堅實的理論和技術支援。
當下，該課題組的研究重點是使用正交技術（orthogonal technology），進一步證明 RNA 的構象異質性。據介紹，這部分研究目前已經取得突破性進展。
現階段，該團隊致力於利用大語言模型直接將原子力顯微鏡影像轉化為分子座標，簡化結構解析流程和工具，從而為領域提供研究 RNA 分子更有用的工具，以及為 RNA 藥物設計和基因治療提供全新的解決方案。
此外，該課題組還希望利用 RNA 控制基因表達的獨特優勢開發新型 RNA 元件，以用於生物醫學和臨床應用。
參考資料：
1.Degenhardt, M.F.S., Degenhardt, H.F., Bhandari, Y.R. et al. Determining structures of RNA conformers using AFM and deep neural networks. Nature (2024). https://doi.org/10.1038/s41586-024-07559-x
2.Lee, YT., Degenhardt, M.F.S., Skeparnias, I. et al. The conformational space of RNase P RNA in solution. Nature (2024). https://doi.org/10.1038/s41586-024-08336-6
3.Ding, J., Lee, YT., Bhandari, Y. et al. Visualizing RNA conformational and architectural heterogeneity in solution.Nature Communications 14, 714 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-36184-x
運營/排版：劉雅坤、何晨龍