01
研究背景
線粒體氧化磷酸化（OXPHOS）是大腦活動的動力來源，而線粒體功能缺陷與神經退行性和神經精神疾病密切相關。為了深入理解大腦活動和行為的基礎，研究人員需要明確大腦的分子能量景觀。然而，目前的功能性神經影像技術雖然能夠捕捉大腦的動態電活動、代謝和血流動力學狀態，但只能間接反映底層的亞細胞生物能量過程。所有基礎和活動依賴的大腦過程都依賴於細胞能量轉化，即透過線粒體OXPHOS合成ATP。線粒體不僅在能量代謝中發揮重要作用，還參與細胞間訊號傳遞、神經元興奮性調節、神經遞質釋放和炎症過程的調控。因此，線粒體在大腦的大規模網路中具有重要的支援功能。
儘管線粒體在認知和行為中具有顯著影響，但其研究通常侷限於亞微米尺度的細胞生物學領域，這與認知和系統神經科學的毫米級尺度存在顯著的概念和方法學差距。因此，研究人員開發了一種物理體素化方法，將冷凍的人類大腦冠狀切片分割成與神經影像解析度相當的體素，以系統地分析大腦各個區域的線粒體分子和生化多樣性。這一方法不僅為探索大腦正常功能的分子能量景觀奠定了基礎，還為理解與神經精神和神經退行性疾病相關的區域化大腦過程提供了重要資源。
02
研究發現
研究透過對人類大腦進行物理體素化，將冷凍的人類冠狀半球切片分割成703個體素，並在每個皮層和皮下腦體素中分析線粒體表型，包括氧化磷酸化（OXPHOS）酶活性、線粒體DNA和體積密度，以及線粒體特異的呼吸能力。研究發現，人腦中存在由拓撲結構和細胞型別驅動的多樣化線粒體表型。灰質中的線粒體數量比白質多50%以上，且灰質中的線粒體在生化上更最佳化以進行能量轉化，尤其是在最近進化的皮層腦區。透過將這些資料擴充套件到整個大腦，研究建立了一個線性迴歸模型，整合了多種神經影像學模式，以生成線粒體分佈和專業化的全腦地圖。
研究結果揭示了大腦不同區域的線粒體密度和OXPHOS能力的顯著差異。灰質和白質之間的線粒體特徵差異明顯，灰質中線粒體的氧化磷酸化能力和密度顯著高於白質。此外，研究還發現，線粒體的呼吸能力（MRC）在大腦不同區域之間存在顯著差異，尤其是在進化較晚的腦區中，線粒體表現出更高的OXPHOS能力。這些發現為理解大腦的分子能量景觀提供了基礎，並可能與神經精神和神經退行性疾病相關。
03
臨床意義
線粒體分佈與密度：研究顯示灰質中線粒體的密度和呼吸能力顯著高於白質。這種區域性差異可能解釋了某些神經變性疾病主要影響皮層結構的機制。高密度和高能量轉換能力的線粒體可能在支援複雜的認知功能中起到關鍵作用。這一發現提示，在神經變性疾病如中風中，灰質區域可能更容易受到線粒體功能障礙的影響，而白質可能存在一些補償機制來減輕這種影響。 進化與功能的聯絡：研究發現，線粒體的呼吸能力與大腦區域的進化年齡密切相關。較晚進化（如人類和靈長類特有）的腦區顯示出更高的線粒體呼吸能力。這一結果為理解人類進化過程中大腦能量需求的增加提供了證據，並可能幫助解釋某些遺傳性線粒體疾病在認知功能上的特異性脆弱性。 個體化醫學的潛力：研究還開發了一種基於神經影像資料預測線粒體特性的模型。這一模型可以用於生成個體化的MRI基礎上的線粒體表型圖譜，從而有助於檢測和評估神經精神疾病和神經退行性疾病中的線粒體功能變化。 總體而言，這項研究不僅為理解正常的大腦功能提供了分子基礎，還為探索與神經精神和神經退行性疾病相關的大腦區域化過程奠定了基礎。這種對線粒體功能的深入瞭解可能在未來的臨床診斷和治療中發揮重要作用。
04
實驗策略
1. 樣本製備和分割：研究者從一個神經典型人的冷凍大腦中提取了冠狀切片，並使用數控（CNC）切割機在冷凍條件下將其物理分割為703個3×3×3毫米的體素，以保持酶活性和分子完整性。
2. 線粒體表型分析：每個體素樣本被隨機分配到96孔板中，並進行定量分析，包括總蛋白濃度和核DNA含量的質量控制。使用多個生化標記（如檸檬酸合酶活性和線粒體DNA密度）評估線粒體密度，並透過多個OXPHOS酶標記（如複合物I、II和IV）評估氧化磷酸化能力。
3. 資料整合與分析：利用二次實驗室的獨立實驗，確保資料的穩健性，並進行維度縮減和聚類分析，以識別不同的線粒體表型。隨後，將線粒體特徵地圖註冊到標準MNI空間，並執行迴歸分析，將這些地圖與相同腦區的平均MRI讀數相關聯。
4. 模型預測與驗證：建立一個向後線性迴歸模型，將多種神經影像學模態整合在一起，以生成腦全圖的線粒體分佈和專業化預測模型，並驗證該模型在同一供體大腦的獨立腦區中的線粒體特徵預測能力。
5. 轉錄組分析：使用單核RNA測序技術分析來自四個不同腦區的個體核，以研究線粒體的細胞型別特異性。
05
資料解讀
圖1：人腦體素化及對映
Figure 1 為了研究人腦中線粒體特徵的分佈，對死後腦組織進行切片和生化分析，以生成與腦切片上體素座標相關的線粒體特徵矩陣，並將這些特徵對映到標準MNI空間。 A. 為了對人腦進行體素化和特徵對映，將死後腦組織切成約2釐米厚的冠狀切片，使用製冷劑R-134a快速冷凍，並在-80°C下儲存10年。位於前聯合中心後方15.51毫米處的切片被安裝在CNC切割機上，在-25°C的冷凍室中操作。切片的表面被清理和平整後，用0.4毫米鑽頭鑽出3×3毫米的網格，深度為3毫米。手動收集腦體素，並再次清理表面，收集若干50奈米的冷凍切片用於組織學評估。每個超過700個樣本被稱重、均質化，並透過一系列生化測試生成與腦切片上體素座標相關的線粒體特徵矩陣。每個體素根據線粒體複合物的相對活性和豐度進行特徵化。透過降維和聚類分析識別不同的線粒體型別。線粒體特徵圖被註冊到標準MNI空間，並進行迴歸分析，將這些圖與相同腦區的平均MRI讀數相關聯。最後，使用MRI資料預測線粒體特徵，並將線粒體圖擴充套件到整個大腦。 B-D. 收集的體素的基本特性，包括其重量、蛋白質含量和核DNA含量。每個引數值的直方圖顯示在頂部，引數值在腦切片上的對映顯示在底部。腦切片左側的柱狀圖顯示了在相同腦的枕葉中對照灰質、白質和混合灰質和白質樣本中相應值的重複測量，這些樣本在實驗板中用作標準化對照。注意每個面板中的顏色條使用與其對應直方圖的x軸標籤相同的標籤。透過單因素方差分析（ANOVA）和Tukey事後檢驗。 結論：透過對人腦進行體素化和生化分析，成功地生成了與腦切片上體素座標相關的線粒體特徵矩陣，並將這些特徵對映到標準MNI空間，進而預測並擴充套件到整個大腦。
圖2：線粒體密度和呼吸鏈複合物的活性
Figure 2 主要探討了線粒體密度和呼吸鏈複合物活性在不同腦區的分佈和特徵。透過對腦組織的酶活性進行分析，研究了線粒體相關特徵的空間分佈及其與腦區的關係。 a. 為了展示酶活性分析的概況，展示了腦組織切片在體素化前的狀態，並提供了內線粒體膜和呼吸鏈複合物的示意圖。中間部分展示了細胞器幾何形狀、呼吸鏈複合物活性、檸檬酸合酶（CS）和線粒體DNA（mtDNA）密度之間的關係。右側給出了總呼吸鏈複合物活性（TRC）、線粒體密度（MitoD）和線粒體呼吸鏈複合物活性（MRC）的公式。 b-d. 透過TRC、MitoD和MRC的地圖，展示了不同腦區的線粒體特徵。每個面板左側的柱狀圖展示了在不同實驗板上對照灰質（GM）、白質（WM）和混合灰質和白質樣本的重複測量分佈。 e. 基於MNI空間位置，將633個具有所有6個線粒體特徵的體素分為GM、WM和混合GM和WM簇。UMAP圖展示了簇與每個體素的物理位置或TRC、MitoD和MRC的z分值之間的相關性。 f. GM、WM和混合GM和WM體素中線粒體特徵的柱狀圖和須狀圖。 g. GM體素線粒體特徵的UMAP圖和簇。 h. 將UMAP簇對映到特定腦區。 i. GM簇中的線粒體特徵，MitoD僅在簇1中與其他簇不同。 j. 對映到特定腦區的體素組中的線粒體特徵。皮質下區域用較深的顏色表示。 k. 皮質和皮質下區域中的線粒體特徵。 l. 測量值與透過比較解剖學研究得出的已知腦區系統發育組織的比較。ρ為Spearman相關係數。 結論：該圖透過分析線粒體密度和呼吸鏈複合物活性在不同腦區的分佈，揭示了這些特徵與腦區功能和結構的關係，提供了對腦區線粒體特徵的深入理解。
圖3：選定體素的單核RNA測序分析
Figure 3 展示了使用單核RNA測序（snRNA-seq）方法對選定的人腦體素進行的分析，揭示了不同腦區和細胞型別之間的線粒體基因表達特徵。以下是figure 3的詳細解讀： a. 圖的左側展示了用於snRNA-seq分析的體素位置及其組織學評估。具體來說，薄切片腦組織使用Nissl染色（標記所有細胞核）和NeuN免疫標記（標記神經元細胞）進行染色，標尺為100 µm。這樣的染色確認了所選體素的細胞身份以及預期的細胞組成。 b. 使用單核RNA測序分析的四個體素中的細胞簇UMAP圖，顯示了九種主要細胞型別。這些細胞型別包括神經元、星形膠質細胞和少突膠質細胞等。 c. 不同體素中細胞型別的比例。不同的腦區顯示出預期的細胞組成差異，例如皮層、海馬、紋狀體和胼胝體顯示出各自特有的細胞型別比例。 d. 顯示了各個體素中的氧化磷酸化（OXPHOS）通路基因表達評分熱圖，以及測得的酶活性。這些分析揭示了各腦區和細胞型別中線粒體轉錄本的不同。 e. 透過對相同腦區中不同細胞型別的複雜I（CI）和IV（CIV）氧化磷酸化複合體的mRNA丰度比較，由原始表達水平得出的CI和CIV相關性，展示了氧化磷酸化轉錄特徵主要受腦區影響。 f. 計算149個線粒體通路的表達評分熱圖。樣本按體素型別（第一行）和細胞型別（第二行）著色，傳達出樣品更傾向於按腦區（而非細胞型別）聚類。 g. g圖例中的細胞型別著色顯示了CI和CIV z-score歸一化表達水平的相關性。這一步調和了特定區域的表達差異，使得不同細胞型別的線粒體特徵更加明顯。 h. 熱圖顯示了在每個樣本中歸一化的線粒體通路表達評分，在去除體素間總表達水平差異後，展示了按細胞型別，而非地理位置進行的明顯聚類。 總體而言，單核轉錄組分析表明，儘管存線上粒體表型的細胞特異性差異，但包含所有細胞型別的線粒體基因表達主要由腦區中的全域性驅動因子影響。這與腦功能組織的拓撲學理解一致。
圖4：整個大腦的線粒體活性預測
Figure 4 展現了研究中利用MRI特徵預測整個人腦線粒體活性的結果。以下是figure 4的詳細解讀： a. 散點圖展示了20%的測試樣本中對線粒體特徵（如比率、複雜酶等）的預測資料。透過比較測試樣本中實際觀測值和預測值，驗證了模型的準確性。圖中的斜率均顯著大於零，顯示了Predicted和Observed資料之間的強相關性。 b. 散點圖顯示了基於腦區而非單獨樣本的觀測與預測線粒體特徵之間的相關性。同時，使用了學習和測試樣本。依據腦區的樣本數量較具統計顯著性，並進一步強調了腦區中的線粒體表型差異。 c-e. 展示了預測的整個大腦線粒體引數在大腦外側（c）、內側（d）表面的分佈，以及白質連線（e）的空間分佈。提供了多個線粒體特徵的全腦3D對映結果，顯示了區域特異性，其中某些區域的線粒體專門化程度尤其高。 f. 利用使用UMAP降維後資料的全腦的無監督聚類結果標示了不同的線粒體活性分佈，表明了灰質和白質區域中的明顯分界。 g. 令人感興趣的是，圖中顯示了大腦不同區域被認為是灰質還是白質的機率，以及在特定腦結構（如額顳枕下束、上縱束等）中的可能性。 h. 影像展示了腦枕葉切片在銑削前的情況。表中彙總了使用同一供體腦枕葉樣品的實際測量線粒體特徵與透過MRI引數預測的線粒體特徵的對比。 這些結果表明，利用常規MRI引數可以準確預測整個人腦中的線粒體生物化學和分子特徵。模型在腦區間和細胞層級上均表明了線粒體的特異專門化，對描繪複雜腦功能所需的能量基礎具有啟示。
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主要結論
這篇研究揭示了人類大腦中的線粒體多樣性和呼吸能力，特別是在灰質和白質之間的差異。研究表明，灰質中的線粒體數量比白質多50%以上，並且灰質中的線粒體在生化上經過最佳化，以更有效地進行能量轉換，尤其是在新進化的皮質區域。此外，研究還建立了一個迴歸模型，可以利用常見的MRI資料預測全腦的線粒體分佈和特化情況。這一研究為探索支援正常大腦功能的分子能量景觀提供了基礎，並且與神經影像資料相關聯，定義了與神經精神和神經退行性疾病相關的區域化大腦過程的亞細胞基礎。
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討論總結
研究透過物理分割和分子表型分析揭示了人類大腦中線粒體的分佈和多樣性，尤其在灰質和白質之間，以及在關鍵腦區之間的顯著差異。研究發現灰質區域的線粒體特化與已知的區域代謝需求變化相一致，這可能解釋了為什麼線粒體疾病容易影響皮質結構。此外，線粒體在能量轉換方面的特化與人類進化模式相一致，提供了有關人類特有認知功能的亞細胞生物能學基礎的見解。研究結果還為未來透過常見神經成像技術推測線粒體特性提供了一種方法，可以用於更好地理解大腦功能和失調的線粒體和能量基礎。
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