01
研究背景
在COVID-19疫情初期，兒童感染SARS-CoV-2後通常症狀較輕，顯示出某種免疫優勢。然而，2020年4月，英國的兒科重症監護醫生觀察到一組與SARS-CoV-2感染相關的高炎症性休克病例，同時義大利的兒科醫生也注意到類似川崎病的增加。這些患者通常在感染SARS-CoV-2後的四到八週內出現中毒性休克和川崎休克綜合徵的症狀，如果不治療，這種涉及多個器官的高炎症反應（MIS-C）可能導致器官衰竭。儘管進行了廣泛研究，MIS-C的發病機制仍未完全闡明。研究表明，這可能涉及病毒清除障礙和腸道屏障功能障礙，儘管在一些研究中觀察到了自身抗體的形成，但這些抗體的特異性在不同研究中有所不同。
MIS-C的病理生物學仍然不完全清楚，一些研究者假設其與一種類似超抗原的免疫反應有關，因為MIS-C與一種獨特的T細胞擴增和/或與TCRVβ21.3 CD4和CD8 T細胞相關的啟用有關。結構模型預測SARS-CoV-2刺突蛋白中存在一個類似超抗原的區域，可以與TCRVβ21.3結合。然而，MIS-C的前COVID-19資料表明，SARS-CoV-2刺突蛋白不是TCRVβ21.3 T細胞擴增所必需的。研究還發現，約1%的MIS-C兒童中存在寡腺苷酸合成酶（OAS）–RNAse L通路的常染色體隱性缺陷，強調了單核細胞啟用的作用。為了澄清MIS-C的發病機制，研究團隊在四大洲的六個中心進行了多中心研究，涉及145名MIS-C患者和221名兒科對照。
02
研究發現
研究發現，MIS-C患者體內TGFβ水平顯著升高，這種升高與T細胞的功能障礙有關，導致EB病毒（EBV）的再啟用和隨後的全身性炎症。具體來說，MIS-C患者的T細胞、B細胞和單核細胞中存在TGFβ反應特徵，單核細胞的抗原呈遞能力減弱，而透過阻斷TGFβ可以逆轉這些功能障礙。此外，MIS-C患者的T細胞受體（TCR）譜系中出現了類似於EBV反應性T細胞克隆的擴增，這些克隆能夠消滅EBV感染的B細胞。研究還發現，MIS-C患者的血清TGFβ可以觸發EBV再啟用，這種再啟用可以透過TGFβ阻斷來逆轉。
研究表明，MIS-C患者的T細胞在抗原特異性反應中表現出功能障礙，尤其是在急性期，這種功能障礙與TGFβ的上調密切相關。透過體外實驗，研究發現TGFβ顯著抑制了健康供體T細胞的反應性，而透過使用抗TGFβ抗體可以部分恢復這種反應性。此外，MIS-C患者的T細胞中TCRVβ21.3亞群的擴增與EBV特異性反應有關，提示這些T細胞可能在MIS-C的病理生理過程中發揮重要作用。研究還指出，MIS-C患者中EBV的高血清陽性率和TGFβ水平的升高可能增加了EBV再啟用的易感性，從而影響疾病的嚴重程度。
03
臨床意義
TGFβ在MIS-C患者中的過度表達與T細胞的功能障礙密切相關，特別是其對EBV再啟用的影響。這一發現為MIS-C的診斷和治療提供了潛在的新靶點。透過阻斷TGFβ的作用，可以部分恢復T細胞的功能，並減少EBV的再啟用，這提示TGFβ阻斷劑可能是MIS-C的一種有效治療策略。此外，MIS-C患者中較高的EBV血清陽性率提示，EBV感染或再啟用可能加重MIS-C的病情。總體而言，這些結果為MIS-C的臨床管理提供了新的見解，強調了免疫調節在MIS-C治療中的重要性。
04
實驗策略
1. 樣本收集與分組：研究者從全球6箇中心收集了145名MIS-C患者和221名兒科對照樣本。對這些樣本進行血清TGFβ水平、免疫細胞特徵和病毒反應性T細胞的分析。
2. 細胞因子分析：透過多重細胞因子檢測，比較MIS-C急性期和隨訪期患者的血清TGFβ1水平，並與不同嚴重程度的COVID-19患者及健康對照進行對比。
3. 細胞實驗：評估TGFβ對健康供體T細胞中SMAD2/3磷酸化的影響，透過單細胞RNA測序分析MIS-C患者PBMCs中TGFβ響應特徵。
4. 細胞因子篩查：透過ELISA和多重細胞因子分析技術，測量MIS-C患者血清中TGFβ1和其他細胞因子的水平。
5. 單細胞RNA測序（scRNA-seq）：對從患者和對照中分選的外周血單個核細胞（PBMCs）進行單細胞RNA測序，以分析免疫細胞的基因表達譜和TGFβ訊號通路的啟用情況。
6. T細胞反應性測試：使用抗原特異性刺激檢測MIS-C患者T細胞對病毒肽段的反應性，評估TGFβ對T細胞活化的抑制作用。
05
資料解讀
圖1：MIS-C中的細胞因子特徵及其對免疫細胞組分的影響
Figure 1 研究了多系統炎症綜合徵（MIS-C）患者的細胞因子特徵及其對免疫細胞組分的影響。a. 實驗設計示意圖展示了實驗設定。該實驗旨在研究MIS-C患者的細胞因子特徵及其對免疫細胞的影響。b. 為了比較MIS-C患者與其他組的血清TGFβ1水平，對MIS-C患者在住院前7天（n=22）及隨訪期間（n=28個時間點，23名患者）的血清TGFβ1水平進行了測量，並與以下組別進行了比較：SARS-CoV-2感染後6周的兒科對照組（無MIS-C，n=11，其中5名患有基礎風溼病），急性流感患者（n=14），無症狀或輕度SARS-CoV-2感染者（n=57，其中13名無症狀），中度或重度SARS-CoV-2感染者（n=42，其中2名重症），以及未感染兒童（健康組，n=40，其中5名患有基礎風溼病）。此外，還與先前發表的健康成人（30歲以下，n=7）、上呼吸道感染成人（n=13）以及COVID-19感染初期的成人（輕度n=19，中度n=12，重度n=34）的TGFβ1水平進行了比較。結果顯示，MIS-C患者的血清TGFβ1水平顯著高於對照組。c. 為了研究MIS-C患者血清對健康供體T細胞的影響，將健康供體的T細胞（n=2）與MIS-C患者的血清（n=4，其中3名已開始治療）共同孵育，並使用中和抗體TGFβ進行處理，隨後透過毛細管免疫印跡實驗定量SMAD2/3磷酸化水平。結果顯示，MIS-C患者血清能夠顯著促進SMAD2/3的磷酸化。d-g. 為了分析MIS-C患者外周血單個核細胞（PBMCs）的單細胞RNA測序（scRNA-seq），透過流式細胞術富集單核細胞、HLA-DRhiCD38 T細胞和CD27 B細胞，分別來自4名兒科對照組（6周後無MIS-C）和11名MIS-C患者（分選策略見擴充套件資料圖2b）。d. UMAP展示了來自6周後無MIS-C對照組的6,589個細胞和MIS-C組的34,794個細胞，按佇列分離並稀釋。簇顏色為無監督分類。個體患者的UMAP見擴充套件資料圖2j。e-g. 分析了不同簇的細胞頻率，簇3、4、7和18（e），簇8、2和13，以及15（f）和簇1和9（g）。甲基強的松龍治療用顏色編碼表示，線條代表中位數。其他簇頻率見擴充套件資料圖2k-n。結論：MIS-C患者的血清TGFβ1水平顯著升高，並能夠促進健康供體T細胞的SMAD2/3磷酸化。此外，MIS-C患者的免疫細胞組分與對照組存在顯著差異。
圖2：急性MIS-C期T細胞反應性受TGFβ影響
Figure 2 探討了在多系統炎症綜合徵（MIS-C）急性期，T細胞反應性受TGFβ的影響。A. 為了研究TGFβ對T細胞的影響，使用之前定義的TGFβ基因集對T細胞進行了基因集富集分析（GSEA），結果透過UMAP和點圖展示。分析顯示TGFβ訊號通路在MIS-C患者的T細胞中顯著富集。B. 對單核細胞群體應用‘Li M200抗原加工和呈遞’基因集進行GSEA分析，結果透過UMAP和點圖展示。分析顯示MIS-C患者的單核細胞中抗原加工和呈遞通路的活性降低。C. 圖示展示了T細胞再啟用實驗的示意圖，用於說明實驗流程。D. 檢測了MIS-C患者急性期和症狀消退後隨訪期的CD4或CD8記憶T細胞（T+++++++mem, CD45RO）的總啟用頻率（CD69）和抗原特異性再啟用頻率（CD137CD69和CD154CD69）。結果顯示，在急性期，MIS-C患者的T細胞啟用和再啟用頻率降低。E. 為了驗證TGFβ在MIS-C患者血清中對健康供體T細胞的影響，將健康供體的CD4和CD8記憶T細胞（T+++mem; CD45RO）與MIS-C患者血清共同培養，結果顯示MIS-C患者血清處理組的T細胞啟用和再啟用頻率降低。F. 將健康供體的CD4和CD8記憶T細胞與重症COVID-19患者血清共同培養，結果顯示COVID-19患者血清處理組的T細胞啟用和再啟用頻率也降低，但加入抗TGFβ後，T細胞的啟用和再啟用頻率顯著恢復。結論：MIS-C急性期T細胞反應性受TGFβ抑制，TGFβ可能透過影響T細胞和單核細胞的訊號通路，導致T細胞功能受損。
圖3：特定亞群的TRBV11-2 T細胞在MIS-C期間的擴增
Figure 3 研究了TRBV11-2 T細胞在多系統炎症綜合徵（MIS-C）中的擴增情況。A. 為了研究TRBV11-2 T細胞在MIS-C中的擴增情況，在UMAP圖上展示了富集的活化細胞，其中包括6周後的小兒對照組和MIS-C患者。結果顯示，TRBV11-2 T細胞在MIS-C患者中有明顯的擴增。B. 在UMAP圖上疊加了CD8a和CD4基因的表達（僅在T細胞上顯示CD4表達以便於觀察）。結果表明，MIS-C患者中CD8a和CD4基因的表達模式與對照組存在差異。C. 透過流式細胞術分析了MIS-C患者中TCRVβ21.3 T細胞在CD4或CD8 T細胞中的比例。研究物件包括未治療的患者（n=9）、接受1-3天1-2 mg/kg甲潑尼龍治療的患者（n=2）和接受1-3天20-30 mg/kg甲潑尼龍治療的患者（n=10）。透過雙尾Fisher精確檢驗確定TCRVβ21.3 T細胞擴增的顯著性。結果顯示，未經治療的MIS-C患者中TCRVβ21.3 T細胞的擴增顯著高於治療組。D. 為了驗證TRBV11-2 T細胞在MIS-C急性期的擴增，使用流式細胞術在兩個獨立的歐洲（法國和義大利；n=19）和南美（智利；n=13）佇列中對單細胞TCR測序資料進行了蛋白定量驗證。結果表明，MIS-C患者中TRBV11-2 T細胞的頻率顯著高於對照組。E. 研究了與TRBV11-2相關的TRAV基因的分佈情況，並根據d中的顏色編碼顯示了甲潑尼龍治療的情況；MIS-C表示取樣在治療開始之前。透過雙側Mann–Whitney U檢驗和雙側Wilcoxon匹配對符號秩檢驗分析，結果顯示，TRAV基因的分佈與TRBV11-2的擴增相關。結論：MIS-C患者中TRBV11-2 T細胞的特定亞群顯著擴增，這一現象在不同的地理佇列中得到了驗證，並且與甲潑尼龍治療相關。
圖4：MIS-C中擴增的T細胞的TCR庫與EBV特異性TCR庫的重疊
Figure 4 為了研究MIS-C（多系統炎症綜合徵）中擴增的T細胞與病毒特異性TCR庫之間的關係，對不同病毒特異性的T細胞進行了TCR測序和分析。a. 為了生成病毒特異性TCR庫並比較其與MIS-C特異性TCR的關係，設計了實驗方案。透過對病毒特異性TCR庫的生成和與MIS-C特異性TCR的比較，展示了實驗的整體流程。b. 透過UMAP分析了來自供體的22,344個病毒特異性T細胞，這些T細胞經過EBV、CMV、SARS-CoV-2或麻疹肽的再刺激，代表了18,010個測序的TCRβ鏈和15,496個完整的TCR。AdV特異性T細胞也進行了TCR測序。不同病毒特異性透過顏色編碼進行區分。c. 將TRVB11-2 T細胞疊加在b中的UMAP圖上，展示了這些T細胞在UMAP圖中的分佈。d. 將基因表達疊加在抗原特異性T細胞的UMAP圖上，顯示大多數TRVB11-2 T細胞具有CD4或CD8細胞毒性表型。e. 透過ARTE分析了來自健康供體的EBV、CMV、SARS-CoV-2、麻疹和AdV病毒特異性T細胞的TCR庫。熱圖展示了與TRBV11-2陽性T細胞相關的TRAV基因表達在病毒特異性和MIS-C T細胞中的分佈，並與6周後無MIS-C和兒童流感T細胞進行了比較。f. 透過ARTE分析了在EBNA2275–294或EBNA2279–289肽刺激後的記憶T細胞中TCRVβ21.3的表達。分析了供體中所有CD4和CD8記憶T細胞及那些具有抗原特異性再啟用的細胞中TCRVβ21.3的頻率。流式細胞術的門控顯示在擴充套件資料圖8c中。使用雙側配對t檢驗進行統計分析。結論：MIS-C中擴增的T細胞的TCR庫與EBV特異性TCR庫存在重疊，提示這些T細胞可能在MIS-C的免疫反應中發揮作用。
圖5：EBV在MIS-C中的再啟用顯著
Figure 5 旨在研究EBV（Epstein-Barr病毒）在多系統炎症綜合徵（MIS-C）中的再啟用情況。A. 為了研究自體T細胞的殺傷能力，設計了自體T細胞殺傷實驗。B-C. 透過流式細胞術測量了與EBV轉染的淋巴母細胞系（LCLs）共培養的CD8 T細胞的存活LCL計數和CD107a表達。CD8 T細胞與LCLs以1:1的比例共培養4小時，CD4 T細胞與LCLs以30:1的比例共培養24小時。結果顯示，與未與T細胞共培養的LCL相比，CD8 T細胞和CD4 T細胞均表現出對LCLs的殺傷活性。D. 透過比較MIS-C患者與年齡匹配的對照組、具有高TGFβ的COVID-19兒科患者及其健康對照組的EBV血清流行率，發現MIS-C患者的EBV血清流行率較高。E. 透過比較不同年齡段的MIS-C患者與健康對照組的EBV血清流行率，發現MIS-C患者在各年齡段的EBV血清流行率均較高。F. 比較MIS-C患者與當地兒科對照組的EBV抗體滴度，結果顯示MIS-C患者的EBV抗體滴度顯著升高。G. 透過分析活化B細胞和漿母細胞資料集中未對映的讀取序列，檢測其與EBV基因組的匹配情況，結果表明MIS-C患者中存在EBV基因組的再啟用。H. 透過定量PCR測量來自輕度或無症狀COVID-19、重症COVID-19、MIS-C或其他嚴重病毒感染的兒童的無細胞血漿中的病毒載量，結果顯示MIS-C患者的EBV載量顯著升高。I. 在MIS-C患者的全血中檢測EBV DNA，結果顯示MIS-C患者中存在EBV DNA。結論：EBV在MIS-C患者中表現出顯著的再啟用現象，提示EBV可能在MIS-C的病理機制中發揮重要作用。
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主要結論
這篇論文揭示了SARS-CoV-2感染與兒童多系統炎症綜合徵（MIS-C）之間的關係，強調了轉化生長因子β（TGFβ）在MIS-C中的關鍵作用。研究發現，MIS-C患者的TGFβ水平顯著升高，導致T細胞細胞毒性受損，並引發EB病毒（EBV）重新啟用。這種病毒重新啟用可能促進MIS-C的全身性高炎症反應。透過阻斷TGFβ，可以逆轉T細胞功能障礙，減少EBV的重新啟用。
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討論總結
研究確認TGFβ在MIS-C中的關鍵作用。TGFβ透過抑制T細胞的細胞毒性影響，使得EBV能夠重新啟用，並可能導致進一步的炎症反應。研究還指出MIS-C患者中EBV的高血清陽性率和高TGFβ水平增加了EBV重新啟用的易感性，進而影響疾病的嚴重程度。研究者建議，針對TGFβ的阻斷治療可能有助於管理MIS-C和其他COVID-19後遺症。此外，針對EBV或SARS-CoV-2的特異性T細胞療法，以及限制EBV複製的抗病毒治療，可能有助於緩解病毒引發的高炎症反應。研究強調了TGFβ作為治療靶點的潛力，特別是在疾病的較晚階段。複製
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