大腦是高等生命體最複雜的器官。在其自然狀態下實現對神經元、神經膠質細胞和微血管系統的非侵入式活體高分辨成像對於促進理解大腦生理機能和疾病至關重要。為了實現這一目標，研究人員一直致力於研發能穿過顱骨的大腦活體成像技術。雖然超聲成像、正電子發射斷層掃描、磁共振成像等技術都能對大腦進行無損成像，但卻無法提供足夠的空間解析度來解析亞細胞水平的生物結構和功能。光學顯微鏡的獨到之處在於能夠以高空間解析度提供活體樣本的結構和功能資訊。然而，當光波在不均勻生物組織（例如哺乳動物顱骨和大腦組織）中傳輸時就會遇到組織產生的光學像差和散射，從而限制了光學成像的解析度和深度。
近年發展的三光子顯微鏡（3PM）技術是一種使用長激發波長和高階非線性激發的光學成像方法。與其他光學成像技術相比，3PM有效地減少了散射和背景熒光，在對哺乳動物大腦成像方面已經顯示出巨大的潛力。然而，不透明的顱骨和腦組織仍然會嚴重衰減激發和發射光子併產生光學像差和散射，從而降低成像質量和深度。自適應光學（AO）是一種校正光波波前畸變的方法，最早用於大型天文望遠鏡排除大氣產生的像差實現高分辨成像。近10多年 AO 已被應用於光學顯微鏡領域，透過校正組織像差來提高成像解析度。然而，傳統 AO 技術的波前測量精度和像差矯正準確性都隨著成像深度的增加迅速下降。因此，如何在弱訊號和大散射情況下準確測量並矯正像差對於在組織深層實現高分辨成像是一個巨大的挑戰。
近日，香港科技大學瞿佳男/葉玉如研究組在 Nature Biotechnology 期刊上線上發表了題為：Deep tissue multi-photon imaging using adaptive optics with direct focus sensing and shaping 的研究論文
研究團隊在近年發展了多項 AO 顯微成像技術的基礎上，開發了一種新型活體自適應光學三光子顯微成像（AO-3PM）系統。該系統結合全新自適應光學技術和三光子顯微成像，實現了穿過活體小鼠完整頭骨在大腦深層的高解析度大視場成像。AO-3PM 大幅提升了非侵入式活體成像的影像質量，為無損研究大腦結構和功能提供了又一強有力的工具。
在這項工作中，研究團隊發明了一種稱為 analog lock-in phase-detection for focus sensing and shaping（ALPHA-FSS 或 -FSS）的 AO 技術，對激發光的相位進行特定調製，再利用相敏探測方法對生物組織引入的低階和高階像差進行快速精確測量及矯正（圖1）。實驗證明-FSS 技術能夠在大背景噪聲情況下顯著提高測量的信噪比，直接得到激發光在顯微鏡焦面的電場幅值和相位，並用於準確校正小鼠頭骨及大腦組織產生的像差和部分散射。不僅如此，AO-3PM 系統還包括另一套共軛自適應光學技術，用於克服矯正波前和生物組織像差隨著掃描角度變大迅速解耦的問題，顯著擴大了-FSS 的矯正有效範圍和高分辨成像的視場。
圖1：-FSS-3PM系統及對100um厚小鼠頭骨引起的像差矯正。(A) AO-3PM系統結構圖。(B) 100um厚的頭骨下300um深處熒光珠在X-Y平面和X-Z平面的影像，未矯正組織像差（左），-FSS矯正組織像差（右）。(C) 空間光調製器上的矯正圖案。(D) B圖中沿虛線熒光訊號輪廓。比例尺：(B) 2um。
研究人員使用1300nm波長的飛秒脈衝雷射作為激發光驗證了 AO-3PM 的成像效能，展示了穿過小鼠完整頭骨的體內和體外成像。與傳統的三光子顯微成像相比， AO-3PM 能夠獲得更高的空間解析度，並提升在小鼠大腦深層熒光訊號強度最高達數百倍。憑藉對低階和高階像差的矯正能力，AO-3PM 可以在保留完整頭骨的情況下能夠清晰分辨深皮質區的神經元胞體和樹突以及微血管的精細結構，實現了穿過小鼠完整頭骨在軟腦膜下方750 µm深處的無損高解析度成像（圖2）。
研究團隊還發現 AO-3PM 在大幅提升神經元胞體鈣離子訊號的同時，更能清晰提取出單獨樹突鈣離子訊號，從而可以同步記錄神經元胞體樹突間的電訊號關聯。在去除頭骨後 AO-3PM 還可獲得在軟腦膜下方達1.1 mm 深度的海馬體高解析度結構影像。
圖2：AO-3PM實現活體穿過頭骨對大腦皮質的大範圍高分辨成像。(A) Thy1-YFP轉基因小鼠大腦內150X150X780um^3範圍內對黃色熒光蛋白（YFP）標記的神經元（橙色）和Texas Red Dextran標記的微血管（紅色）的高分辨成像。(B) 椎體神經元的最大強度投影（腦膜下方545-555um），未矯正組織像差（上），-FSS矯正組織像差（下）。比例尺：(B) 大圖20um，小圖5um
最後，研究人員利用 AO-3PM 在保留完整頭骨情況下實現了精密雷射損傷，並以此研究了微小損傷後大腦皮質內小膠質細胞的響應過程（圖3）。結果顯示 AO-3PM 成像可清晰分辨小膠質細胞突起向微米級雷射損傷點伸張和包裹的完整過程，有助於研究活體狀況下免疫細胞對大腦環境變化的動態反應。同時，研究還表明 AO-3 PM產生的精密微小雷射損傷只引起區域性免疫細胞的迅速反應，而100微米外相鄰大腦皮質的小膠質細胞並不會發生形態和位置的變化。
為了驗證在更大像差和散射情況下 AO-3PM 的效能，研究人員進一步對老年阿茲海默症老鼠大腦的小膠質細胞和澱粉樣斑塊進行活體成像。結果顯示穿過其140um 厚的完整頭骨，AO-3PM 仍然能清晰分辨膠質細胞的精細形態和與澱粉樣斑塊的相互作用。
圖3：AO-3PM實現活體穿過頭骨精確雷射手術以及老年阿茲海默症老鼠大腦內對小膠質細胞高分辨成像。(A) 雷射手術後對Cx3Cr1-GFP轉基因老鼠內被綠色熒光蛋白標記的小膠質細胞間隔時間成像。(B) 空間光調製器上的矯正圖案。(C) A圖中沿虛線熒光訊號輪廓。(D) 在12個月大的老年阿茲海默症老鼠大腦對小膠質細胞和澱粉樣斑塊的雙色成像。比例尺：(A) 20um；(D) 10um。
總體而言，這項研究結果表明，AO-3PM 技術在促進活體生物高分辨成像特別是在活體大腦無創成像研究方面具有巨大潛力。
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https://doi.org/10.1038/s41587-022-01343-w
來源: Brainology