01
研究背景
動物行為在出生後發育過程中發生顯著變化，感官體驗隨著感官器官的成熟而改變，生理需求如睡眠、體溫調節和飢餓感在年輕動物達到獨立時以不同方式得到滿足。社會關係也發生變化；在哺乳動物中，與父母的互動隨著斷奶而改變，性別特異性的生殖和防禦行為在青春期後出現。儘管關於物種和性別特異性行為的遺傳和環境資訊的作用存在激烈爭論，但相應腦回路的發育機制仍然知之甚少。研究表明，環境資訊對於社會和生存行為的適當成熟至關重要，但關鍵時期如何塑造相應的神經元群體仍不清楚。研究透過對POA的詳細分析，提供了關於這些功能在早期生活中的動態的新見解。
這篇論文探討了哺乳動物在早期生活階段行為和生理的重大變化，特別是在斷奶和青春期時的轉變。研究的重點是下丘腦前視區（POA）神經元群體的發育軌跡，這些神經元在生理和行為控制中起關鍵作用。研究團隊透過轉錄組學和染色質可及性分析，揭示了這些神經元群體的發育多樣性，這種多樣性受到動物性別、細胞型別的功能和位置的影響。研究確定了前視區發育的關鍵階段，包括早期的多樣化、圍產期性別差異的出現、出生後的成熟以及訊號網路的精細化。研究還發現，嗅覺系統，特別是犁鼻器感知在前視區細胞型別成熟的時機中起到重要作用。
02
研究發現
研究發現，POA神經元的發育受到動物性別、細胞型別的功能和位置的顯著影響。研究透過轉錄組和染色質可及性分析，揭示了POA神經元在不同發育階段的多樣性，包括早期的多樣化、圍產期性別差異的出現、出生後的成熟和訊號網路的精細化，以及在斷奶和青春期時加速的非線性轉錄變化。研究還發現，犁鼻器感知在確保POA細胞型別成熟的時間上起著重要作用。這些結果為控制體內平衡功能和社會行為的神經元發育提供了新的見解，併為研究這些功能在早期生活中的動態變化奠定了基礎。
研究總結了POA神經元型別的發育軌跡，發現這些神經元在胚胎期就已經多樣化，並在出生後經歷了幾個關鍵的成熟階段。研究指出，P0到P10之間是POA區域化過程的關鍵時期，訊號網路在此時建立，而P10到P18和P28到P65則是兩個重要的成熟階段，分別對應於斷奶和青春期。研究還發現，性別對成熟的時間和方式有廣泛影響，包括圍產期性別差異的出現和青春期的動態性別差異。最後，研究表明，感官輸入，特別是來自犁鼻器的輸入，對POA細胞型別的成熟時間有顯著影響，而其他感官輸入如觸覺和視覺則影響較小。
03
臨床意義
性別差異的早期出現：研究發現，性別差異在圍產期就開始顯現，並在青春期加速。這提示在某些神經和行為障礙（如自閉症譜系障礙和性別發育障礙）中，性別可能在早期就產生影響。 感覺輸入對發育的影響：研究指出，犁鼻器感覺在POA細胞型別成熟的時機中起重要作用。這表明感覺輸入對大腦關鍵區域的發育有顯著影響，對於理解感覺處理異常如何導致行為障礙提供了新視角。 關鍵發育階段識別：研究識別了POA發育的關鍵階段，包括早期多樣化、圍產期性別差異的出現、出生後的成熟和訊號網路的精煉。這些階段的識別有助於理解在這些關鍵視窗中干預可能對行為和生理功能的長期影響。 行為和生理功能的發育機制：透過分析不同神經元型別在不同發育階段的基因表達變化，研究揭示了與睡眠、飲食、性行為等相關的神經網路是如何逐步形成和成熟的。這為解釋某些行為和生理紊亂的發生機制提供了基礎。 總的來說，該研究為理解哺乳動物早期生活中的神經發育過程及其對行為和生理功能的影響提供了重要的基礎，可能對未來開發針對相關神經和行為障礙的干預策略具有指導意義。
04
實驗策略
1. 樣本收集與製備：研究團隊從小鼠的不同發育階段（從胚胎第16天到成年期）收集了POA和周邊區域的樣本，並進行了單核RNA測序（snRNA-seq）和單核染色質可及性測序（snATAC-seq）。
2. 資料分析： 使用了配對的snRNA-seq和snATAC-seq技術來分析147種神經元型別的發展軌跡。這包括從胚胎到成年期的發育關鍵階段（如出生、斷奶和青春期）。 透過層次聚類和基因標記分析，識別了不同的細胞類群。
3. 發育軌跡與轉錄調控： 研究確定了關鍵的轉錄因子，這些因子在訊號網路的成熟過程中起重要作用。 透過對不同感官突變體的POA進行分析，發現犁鼻器感知在確保正常POA細胞型別成熟時序中的重要角色。
4. 性別差異： 研究顯示了性別在神經元型別成熟中的顯著影響，尤其是在青春期。 性別差異不僅體現在成熟時序上，還體現在基因表達的動態變化上。
5. 感官輸入的影響： 透過對不同感官突變體的研究，發現犁鼻器輸入對絕大多數POA細胞型別的正常發育時序至關重要，而其它感官輸入（如觸覺、視覺）對POA的轉錄成熟影響較小。
05
資料解讀
圖1：下丘腦POA細胞型別在發育過程中的分子圖譜
Figure 1 為了研究下丘腦前視交叉前區（POA）細胞型別在不同發育階段的變化，作者對POA及其周圍區域進行了細胞核提取，並在八個發育階段準備了snRNA-seq和snATAC-seq文庫，每個年齡段包含兩個雄性和兩個雌性樣本。A. 實驗設計示意圖：作者對POA及其周圍區域進行了解剖，提取細胞核，並在八個發育階段準備了snRNA-seq和snATAC-seq文庫，每個年齡段包含兩個雄性和兩個雌性樣本。B. 細胞型別與先前確定的在社會行為或穩態控制中發揮作用的細胞型別的對應關係。C. 在P65階段，使用snRNA-seq對64個興奮性和83個抑制性細胞簇進行層次聚類分析，按照POA亞區域身份進行組織。‘e-’和‘i-’分別表示興奮性和抑制性細胞型別，後跟一個字母表示POA亞區域。D. 使用典型相關分析將E16階段的細胞型別對映到P65階段的細胞簇中，幾乎所有E16細胞型別都對應到單一的P65細胞型別，只有極少數出現非對角線對應。E. 使用統一流形近似與投影（UMAP）對所有八個年齡段的興奮性細胞簇進行降維分析。左圖按簇著色（c圖頂部的關鍵），右圖按年齡著色。插圖顯示三個簇在年齡上的梯度變化。F. 在每個簇中確定差異表達基因（DEGs），並在所有年齡段進行分析（devDEGs）。右側直方圖將devDEGs根據識別的簇數量進行分類：超過70%（‘共享’），少於20%（‘細胞型別特異性’）或介於兩者之間（‘中間’）。底部直方圖顯示每個簇的devDEGs數量。G. 在所有devDEGs中，標準化的細胞型別特異性基因表達變化（擬合趨勢曲線）按時間程序進行聚類（左側彩色條）。H. 四個devDEG簇的示例。每條彩色線表示單個devDEG的細胞型別特異性基因表達變化；每條黑線表示簇中所有devDEGs的平均值。I. 對h中顯示的四個devDEG簇進行GO術語富集分析。結論：透過對POA細胞型別在不同發育階段的分子圖譜分析，研究揭示了細胞型別特異性基因表達的動態變化及其在發育過程中的功能角色。
圖2：前視區細胞型別的發育軌跡
Figure 2 為了研究前視區（POA）不同細胞型別在發育過程中的成熟軌跡，作者透過主成分分析（PCA）空間中的距離變化來量化成熟度，並分析了不同細胞型別在不同年齡段的發育軌跡。A. 為了量化不同細胞型別的成熟度，作者在PCA空間中計算了每個年齡的質心與成年質心之間的距離，這一計算是分別針對每種細胞型別進行的。B. 作者展示了所有細胞型別在不同年齡段的距離軌跡，其中灰色表示所有細胞型別的軌跡，黑色表示平均軌跡，彩色表示感興趣的極端細胞型別。結果以任意單位（a.u.）表示。C. 上圖為不同軌跡類別的示意圖。下圖展示了興奮性細胞型別的距離軌跡。軌跡根據成熟的90%發生在4-5個年齡段（類別1，漸進）、三個年齡段（類別2，中間）或1-2個年齡段（類別3，階躍）分為三類。D. 平均每類的距離軌跡。E. 興奮性細胞型別在不同亞區域的分類分佈比例。F. 與E類似，但針對抑制性細胞型別。G. 所有細胞型別或按功能組劃分的分類分佈比例。H. 抑制性VLPO細胞型別的距離軌跡。透過雙因素方差分析（ANOVA），細胞型別子集的影響顯著，P值為2.15×10^-11。I. 抑制性MPN+VMPO+Pe細胞型別的距離軌跡，P值為5.5×10^-15。J. 在社會行為中起作用的細胞型別的距離軌跡。雙因素ANOVA分析顯示細胞型別子集的影響顯著，P值為1.39×10^-14。K. 在穩態控制中起作用的細胞型別的距離軌跡。雙因素ANOVA分析顯示細胞型別子集的影響不顯著，P值為0.541。L. Eigentrend值總結了選擇的GO術語中發育差異表達基因（devDEGs）在不同年齡段的表達變化。紅色、藍色和橙色三角形分別表示在文字中提到的特別早期（紅色、橙色）或晚期（藍色）變化的簇。結論：前視區不同細胞型別在發育過程中表現出不同的成熟軌跡，這些軌跡可以根據成熟速度和模式進行分類，並且在功能上與細胞的特定角色相關。
圖3：POA神經元訊號傳導的成熟變化
Figure 3 研究了不同年齡階段POA（視前區）神經元訊號傳導的成熟變化，重點關注代謝、進食、睡眠-覺醒調節及性激素訊號傳導相關基因的表達變化。A. 為了研究不同訊號基因類別在不同年齡階段的表達變化，作者對各類訊號基因的表達進行了模組評分，並在不同年齡階段進行z-score標準化。結果顯示，不同訊號基因類別在不同年齡階段的表達存在顯著變化。B. 作者透過精細化評分量化了在P10到P65（精細化階段）期間每個類別中基因的顯著變化數量，並對每個類別中的基因數量進行了標準化。結果表明，不同類別的基因在精細化階段的變化程度不同。C-E. 透過對代謝和進食相關受體基因Mc4r（C）、Glp1r（D）和ghrelin受體Ghsr（E）的對數標準化基因表達分析，作者發現這些基因在不同年齡階段的表達在各個簇內平均化，彩色線條代表示例簇，黑色線條顯示示例簇的平均值。F-J. 對於睡眠-覺醒調節相關受體基因Hrh3（F）、Hcrtr2（G-H）和Drd1（I-J）的表達分析，作者發現這些基因在不同年齡階段的表達在不同細胞型別中存在差異，示例細胞型別包括參與睡眠-覺醒（G）或社會行為（H）的細胞型別，以及基底前腦/HDB（I）或SCN（J）的細胞型別。K-O. 對於性激素訊號傳導相關基因Esr1（K）、Cyp19a1（編碼芳香化酶；L）、Ar（M）、Pgr（N）和Prlr（O）的表達分析，作者發現這些基因在不同年齡階段的表達在各個簇內平均化。P-Q. 透過NeuronChat分析在P10與P65階段AvPe/MnPO和MPN細胞型別之間的神經肽和單胺連線，結果顯示在P10階段（P）比P65階段（Q）有更多的連線上調。R. NeuronChat分析識別出的在P10或P65階段的神經肽和單胺連線數量，按隨年齡上調的順序從左到右排序。S-T. 在P10（S）或P65（T）階段e-A3的輸出連線。U. 類似於R，但僅針對e-A3的外向連線。結論：POA神經元訊號傳導在不同年齡階段表現出顯著的成熟變化，涉及代謝、進食、睡眠-覺醒調節及性激素訊號傳導相關基因的表達變化。這些變化可能與不同細胞型別間的神經肽和單胺連線的成熟有關。
圖4：性別差異在視前區成熟中的表現
Figure 4 研究了小鼠視前區（POA）成熟過程中性別差異的表現，重點分析了不同性別小鼠在抑制性神經元簇中的差異。A. 為了研究不同性別小鼠抑制性神經元簇的成熟軌跡，作者對雄性和雌性小鼠的抑制性神經元簇進行了距離軌跡分析。結果顯示，雄性和雌性小鼠的抑制性神經元簇在成熟過程中表現出不同的距離軌跡。B. 為了比較不同年齡段的性別差異，作者分析了每個簇中雄性和雌性小鼠到成年階段的距離分佈，並進行了雙側t檢驗。結果顯示，隨著年齡的增長，雄性和雌性小鼠在所有細胞型別中的距離差異逐漸顯著，尤其是在特定年齡段（如P值為0.0038、0.0022、0.0001、6.9×10−8、0.035和5.63×10−9）。C. 為了進一步分析簇距離軌跡中的分類分佈，作者計算了不同簇的分類比例，結果顯示不同性別小鼠在成熟過程中表現出不同的分類分佈。D. 在P65階段，作者透過主成分分析（PCA）空間中雄性和雌性樣本質心之間的距離（標準化為性別內距離）以及檢測到的性別差異表達基因（sexDEGs）的數量來測量抑制性神經元簇中的性別差異。結果顯示，雄性和雌性小鼠在抑制性神經元簇中表現出顯著的性別差異。此外，性激素受體的平均基因表達也顯示出性別差異。E. 為了研究在不同年齡段中表現出顯著性別差異的簇，作者檢測了在給定年齡段中檢測到的性別差異表達基因（sexDEGs）的數量。結果表明，隨著年齡的增長，檢測到的性別差異表達基因的數量逐漸增加。結論：該研究揭示了小鼠視前區成熟過程中抑制性神經元簇的性別差異，尤其是在特定年齡段表現出顯著的差異，這可能與性激素受體的表達有關。
圖5：感覺訊號對POA成熟的影響
Figure 5 探討了感覺訊號對前視交叉前區（POA）成熟的影響，特別是透過分析TRPC2基因突變體與對照組之間的差異。A. 為了研究興奮性細胞群中突變體與對照組樣本的差異，作者在主成分分析（PCA）空間中計算了突變體與對照組樣本重心之間的距離，並進行了標準化處理。對照組樣本包括C57BL/6J小鼠和對照同窩小鼠。結果顯示，突變體與對照組樣本在PCA空間中的距離存在差異。B. 為了分析TRPC2 P10實驗中所有細胞群的突變體與對照組之間的PCA距離，作者根據功能角色對資料進行了劃分。結果表明，不同功能角色的細胞群在突變體與對照組之間的PCA距離上存在差異。C. 為了研究Trpc2突變體（-/-）和對照組（-/+同窩小鼠）在不同年齡段的成熟度，作者進行了擬時間對映分析。結果顯示，較高的擬時間值對應於較高的成熟度（更接近成年細胞型別）。在不同年齡段，突變體與對照組的細胞型別在成熟度上存在顯著差異。D. 為了研究核心神經元成熟基因在不同年齡段的表達情況，作者分析了野生型C57BL/6J細胞型別在每個年齡段的基因表達，以及Trpc2-/+和Trpc2-/-細胞型別在P10時的基因表達。結果表明，突變體與對照組在核心神經元成熟基因的表達上存在顯著差異。E. 為了識別在Trpc2-/+和Trpc2-/-細胞型別在P65時表現出差異的細胞型別，作者使用了隨機森林分類器方法（Augur）。每個點代表一個細胞型別，結果顯示，與Trpc2-/-成年小鼠相關的社會行為受影響的細胞型別用彩色點表示。結論：感覺訊號透過影響核心神經元成熟基因的表達和細胞型別的功能角色，顯著影響了POA的成熟過程。
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主要結論
這篇來自哈佛大學的研究透過多組學手段揭示了下丘腦前視區(POA)神經元的發育軌跡。研究顯示，性別、感官輸入和功能在POA細胞型別的發育中起到關鍵作用。透過對小鼠POA不同發育階段的轉錄組和染色質可及性進行分析，研究識別出在生後發育過程中，POA細胞型別的顯著多樣性。這種多樣性受動物性別、細胞型別所在位置以及其行為或生理功能的影響。此外，研究發現，犁鼻器感應在正常POA細胞型別成熟時間中起到重要作用。
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討論總結
性別差異：研究發現性別在POA細胞型別的發育過程中產生廣泛影響。比如，雌性細胞型別在E18到P4期間比雄性更為成熟，而在P4到P10-28期間，雄性成熟更快。感官輸入的影響：研究評估了不同感官突變體中的POA發育，發現犁鼻器輸入對POA發育時間的影響尤為顯著，而視覺和體感輸入的影響相對較小。功能與成熟時間線：不同POA細胞型別表現出特定的成熟軌跡，這與它們的生理功能密切相關。細胞型別的成熟時間線與其神經遞質、所在亞區域或行為功能密切相關。發育階段與訊號網路：研究發現，POA神經元在不同的發育階段形成不同的訊號網路，這些網路在早期（E16到P4）建立，並在青少年期（P10到P65）得到進一步細化。總之，這項研究為理解控制內穩態功能和社會行為的神經元發育提供了新的見解，併為探討這些功能在生命早期的動態變化奠定了基礎。研究指出，POA的發育過程不僅受內在遺傳因素的影響，還對外部環境輸入（如犁鼻器輸入、性激素分泌等）表現出敏感性，這可能解釋了早期生命經驗如何對社會行為或內穩態控制產生長期影響。
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