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研究背景
多藥耐藥（MDR）真菌病原體的感染對人類健康構成了嚴重威脅，尤其是在免疫功能受損人群數量增加以及農業、畜牧業和臨床環境中抗真菌抗生素過度使用的情況下。全球範圍內MDR Candida auris的出現尤其令人擔憂，因為在某些情況下，它對四類主要抗真菌藥物（即多烯類、唑類、棘白菌素類和嘧啶類似物5-氟胞嘧啶）均表現出耐藥性，導致高死亡率和持續傳播。長期以來，發現具有獨特作用機制的抗生素被認為是對抗耐藥病原體的最有效方法。然而，尋找未知抗真菌藥物面臨著鑑定抗真菌靶點稀缺以及傳統基於活性指導的抗真菌藥物發現策略效率降低的挑戰。這些挑戰促使人們應用創新策略來發現具有獨特作用機制的抗真菌劑，以對抗MDR真菌病原體。
微生物次級代謝產物歷來是抗菌化合物的豐富來源，超過70%的臨床使用抗生素是微生物次級代謝產物及其衍生物。在自然界的動態種內競爭中，負責抗生素生產的基因（如編碼強效抗生素的基因）可能不斷進化，使微生物能夠克服抗生素耐藥性挑戰並確保其在生態位中的生存。抗生素生物合成相關基因的進化可能會產生具有多樣結構和獨特作用機制的增強型抗生素。抗生素進化的概念已在先前解決MDR細菌感染的努力中得到應用，導致了macolacin、cilagicin和corbomycin的發現。為了發現具有未描述作用機制的抗真菌藥物，我們實施了一種基於系統發育指導的天然產物發現策略，專注於多烯大環內酯抗生素家族。這個家族因其結構多樣性、強效和廣譜抗真菌活性以及低耐藥性發展可能性而被選中。
02
研究發現
研究團隊透過系統進化引導的天然產物發現平臺，發現了一種新的多烯類抗真菌抗生素——mandimycin。與已知的多烯大環內酯抗生素不同，mandimycin的作用機制是透過靶向真菌細胞膜中的多種磷脂，而非傳統的靶向麥角固醇。這種獨特的作用機制使得mandimycin能夠有效地對抗多藥耐藥的真菌病原體，並且能夠避免產生耐藥性。mandimycin在體外和體內實驗中均表現出強效和廣譜的殺真菌活性。
mandimycin的結構特徵包括一個38元的糖基化多烯大環內酯，具有三個脫氧糖修飾，這使其在水中的溶解度顯著提高，超過臨床使用的多烯類抗真菌藥物兩性黴素B的9700倍。此外，mandimycin在小鼠模型中表現出較低的腎毒性和無溶血效應，顯示出良好的藥代動力學特性和對多種多藥耐藥真菌病原體的強效殺真菌作用。
03
臨床意義
廣譜抗真菌活性：Mandimycin對多種多重耐藥性真菌病原體顯示出強效和廣譜的殺菌活性，並在體內外實驗中表現出色。這一特點使其成為處理MDR真菌感染的有力工具。 新型作用機制：透過靶向真菌細胞膜中的多種磷脂，mandimycin不僅具有強大的殺真菌活性，還能夠有效避免抗藥性的發展。這種多重靶向能力使其在臨床應用中更具優勢。 降低毒性：與傳統的聚烯大環內酯抗生素（如兩性黴素B）相比，mandimycin顯示出更低的腎毒性和更高的水溶性。這意味著在臨床治療中，它可能引發更少的副作用，提高患者的耐受性。 抗藥性：Mandimycin在抗藥性真菌株中未產生任何突變，這表明它可能具有較低的抗藥性發展風險，這對長期有效的抗真菌治療至關重要。 潛在應用：Mandimycin的發現為開發新型抗真菌治療方案提供了一個新的方向，尤其是在面對現有藥物無效的情況下。其獨特的結構和機制可能為治療廣泛的真菌感染提供新選擇。 綜上所述，mandimycin的發現不僅填補了抗真菌藥物開發中的空白，也為應對全球範圍內的MDR真菌感染提供了新的希望。未來的臨床研究將進一步驗證其在真實世界中的療效和安全性。
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實驗策略
1. 系統發育導向的發現平臺： 研究團隊構建了一個系統發育樹，針對負責將mycosamine轉移到大環內酯骨架上的糖基轉移酶進行分析。透過分析這些糖基轉移酶的系統發育關係，研究人員能夠識別出可能含有未被描述的mycosamine的大環內酯多烯抗生素的基因簇。
2. 基因組資料的整合分析： 團隊從美國國家生物技術資訊中心（NCBI）收集了超過31萬種細菌基因組，以及實驗室中測序的150個鏈黴菌基因組。使用抗生素和次級代謝物分析Shell（antiSMASH）工具，對這些基因組中的次級代謝產物生物合成基因簇（BGCs）進行識別和註釋，最終建立了一個本地化微生物次級代謝產物（MiSM）資料庫。
3. 新型抗生素Mandimycin的發現： 在分析中，研究人員發現了不與已知大環內酯多烯抗生素聚集的孤立譜系，其中包括來自Streptomyces netropsis DSM 40259的一個代表性BGC，即Mand BGC。對該基因簇進行深入研究，揭示了Mandimycin的獨特結構和抗真菌活性。
4. Mandimycin的獨特作用機制：Mandimycin透過與真菌細胞膜中的多種磷脂（如磷脂醯肌醇）結合，誘導離子洩漏和細胞坍塌，實現其殺菌效應。相比之下，傳統大環內酯多烯抗生素多作用於麥角固醇。
5. 抗藥性及安全性評估：在體內外實驗中，Mandimycin展示了對多種MDR真菌病原體的有效性和低腎毒性。同時，透過小鼠模型驗證了其在不同感染型別中的治療潛力。
05
資料解讀
圖1：mandimycin的發現和特徵鑑定
Figure 1 展示了mandimycin的發現過程及其化學特徵的鑑定。A. 為了展示mandimycin的生長曲線，進行了BGC（生長曲線）實驗，結果顯示了mandimycin在特定條件下的生長情況。B. 為了比較野生型（WT）S. netropsis DSM 40259和mandL基因敲除突變體的化學成分，使用高效液相色譜（HPLC）對n-丁醇提取物進行分析。結果顯示，野生型和突變體之間的色譜圖存在差異。此外，透過瓊脂擴散實驗檢測了提取物對C. albicans BNCC 186382的抗菌活性，結果表明野生型提取物具有抗菌活性，而突變體提取物的抗菌活性減弱。C. 為了確定mandimycin的化學結構，使用了高分辨電噴霧電離質譜（HR-ESI–MS）、一維和二維核磁共振（NMR）以及生物資訊學預測。結果揭示了mandimycin的化學結構，並指出其為多酮合成酶（PKS）產物。結論：透過一系列實驗，發現並鑑定了mandimycin的化學特徵，並證明其在野生型S. netropsis中具有抗菌活性，而在mandL基因敲除突變體中活性減弱。
圖2：曼迪黴素的抗真菌機制研究
Figure 2 為了探討曼迪黴素對念珠菌的抗真菌機制，研究者進行了多項實驗以揭示其作用方式。a. 為了研究曼迪黴素對白色念珠菌BNCC 186382的殺菌效果，進行了時間依賴性殺菌曲線實驗。透過測量在不同濃度（2×到32×最小抑菌濃度）曼迪黴素處理後0到48小時的菌落形成單位（CFU）計數，結果顯示曼迪黴素具有時間依賴性的殺菌效果。b. 為了評估曼迪黴素對細胞膜完整性的影響，測量了白色念珠菌BNCC 186382在不同濃度曼迪黴素處理後的鉀離子釋放量。結果表明，隨著曼迪黴素濃度的增加，鉀離子的釋放量顯著增加，提示細胞膜受損。c. 使用掃描電子顯微鏡觀察了在32×最小抑菌濃度曼迪黴素處理後的白色念珠菌BNCC 186382。結果顯示，處理後的念珠菌細胞表面出現明顯的損傷和形態變化，進一步支援了曼迪黴素對細胞膜的破壞作用。d. 為了研究曼迪黴素的抗藥性，測量了不同念珠菌菌株在多烯大環內酯類抗生素存在下的突變頻率。使用8×最小抑菌濃度的曼迪黴素、兩性黴素B、納他黴素和制黴菌素誘導109個真菌細胞的抗性突變，結果顯示曼迪黴素的抗藥性突變頻率較低。e,f. 透過等溫滴定量熱法（ITC）分析了曼迪黴素和兩性黴素B與麥角固醇（e）或膽固醇（f）的結合情況。結果顯示曼迪黴素與麥角固醇的結合更強，而與膽固醇的結合較弱，提示其選擇性作用於真菌細胞膜。g. 透過紫外-可見光譜分析了曼迪黴素和兩性黴素B與不同比例麥角固醇共孵育的情況。結果顯示，曼迪黴素與麥角固醇的結合導致光譜變化，進一步支援其與真菌細胞膜的相互作用。結論：曼迪黴素透過破壞真菌細胞膜的完整性，尤其是與麥角固醇的特異性結合，發揮其抗真菌作用。
圖3：磷脂作為mandimycin的靶標的鑑定
Figure 3 旨在探討mandimycin對真菌細胞膜的作用機制，並識別其靶標。A-B. 為了研究mandimycin和兩性黴素B對真菌細胞膜成分的敏感性變化，在固定濃度（1 mg/ml）和不同濃度（0.05–1 mg/ml）的真菌細胞膜成分存在下，測定了mandimycin和兩性黴素B對白色念珠菌BNCC 186382的最小抑菌濃度（MIC）的變化。實驗結果顯示，真菌細胞膜成分的存在對mandimycin和兩性黴素B的MIC產生了顯著影響。C. 透過示意圖展示了mandimycin對真菌細胞膜的作用模式，提出了其可能的作用機制。D. 透過等溫滴定量熱法（ITC）測定了mandimycin和兩性黴素B與磷脂和麥角固醇的結合親和力。實驗使用1,2-二油醯-sn-甘油-3-磷酸膽鹼（DOPC）製成的大單層囊泡（LUVs, 0.1 µm）作為陰性對照。結果表明，mandimycin與磷脂的結合親和力顯著高於陰性對照。E-F. 透過ITC和紫外-可見光譜法分析了mandimycin和兩性黴素B與磷脂醯肌醇（PI）的滴定反應。實驗結果顯示，mandimycin和兩性黴素B與PI的結合產生了明顯的熱效應和光譜變化。G. 透過敲除糖基轉移酶基因mandQ，生產了雙去糖基化的mandimycin B類似物。H-I. 透過ITC和紫外-可見光譜法分析了mandimycin B與麥角固醇和PI的滴定反應。實驗結果顯示，mandimycin B與麥角固醇和PI的結合產生了明顯的熱效應和光譜變化。結論：實驗結果表明，磷脂是mandimycin的主要靶標，且mandimycin與磷脂的結合親和力顯著高於陰性對照，支援了其對真菌細胞膜的作用機制。
圖4：mandimycin的毒性及體內抗真菌活性
Figure 4 主要研究mandimycin的毒性和體內抗真菌活性，透過多種小鼠模型評估其對腎損傷生物標誌物的影響、組織病理學變化、溶血性以及在不同感染模型中的抗真菌效果。A. 為了評估mandimycin對腎損傷生物標誌物的影響，對給予單次靜脈注射的雌性小鼠進行了轉錄分析。結果顯示，mandimycin處理組與對照組相比，腎損傷生物標誌物的表達沒有顯著變化。B. 透過熱圖分析了mandimycin處理後小鼠腎組織的病理評分，包括皮質和髓質的管狀細胞鑄型、管狀變性和壞死、管狀擴張、管狀蛋白鑄型及血管充血和出血。結果表明，mandimycin處理組的病理評分與對照組無顯著差異。C. 在溶血實驗中，使用去纖維化的羊血檢測mandimycin和兩性黴素B的溶血性。結果顯示，mandimycin沒有明顯的溶血作用。D-E. 在中性粒細胞減少的播散性念珠菌病小鼠模型中，研究了不同劑量的mandimycin對感染耐多藥白色念珠菌的存活率和腎臟真菌負荷的影響。結果表明，較高劑量的mandimycin顯著提高了小鼠的存活率，並降低了腎臟的真菌負荷。F-H. 在中性粒細胞減少的大腿感染小鼠模型、皮膚感染小鼠模型和陰道炎小鼠模型中，研究了mandimycin對隱球菌和白色念珠菌的體內抗真菌活性。結果顯示，mandimycin在所有模型中均顯著降低了真菌負荷，表現出良好的抗真菌活性。I. 在中性粒細胞減少的大腿感染模型中，研究了mandimycin對感染耐兩性黴素B的耐多藥耳念珠菌的體內抗真菌活性。結果顯示，mandimycin顯著降低了真菌負荷，表現出強效的抗真菌活性。結論：mandimycin在多種小鼠感染模型中表現出良好的體內抗真菌活性，同時未表現出明顯的腎毒性和溶血性，顯示其作為抗真菌治療劑的潛力。
06
主要結論
這篇發表在《Nature》上的文獻介紹了一種名為 Mandimycin 的新型聚烯大環內酯抗真菌抗生素。Mandimycin 是透過一種系統進化導向的天然產物發現平臺被發現的，其獨特之處在於它能夠靶向真菌細胞膜中的多種磷脂，而不是傳統的靶向麥角固醇。研究表明，Mandimycin 對多種多藥耐藥（MDR）真菌病原體具有強效和廣譜的殺菌活性，並且在體外和體內實驗中都展現了良好的效果。由於 Mandimycin 可以結合多個靶點，這賦予了它強大的殺菌活性以及逃避耐藥性的能力。此外，Mandimycin 相較於已知的聚烯大環內酯抗生素（如兩性黴素B）展現出較低的腎毒性和更高的水溶性，這使其在治療上具有潛在的優勢。
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討論總結
Mandimycin 的發現是基於對多種生物合成基因簇（BGCs）的系統進化分析，透過對多糖轉移酶的系統進化分析，研究人員識別出一個孤立的 BGC——mand BGC。Mandimycin 的結構中包含三種脫氧糖，這在已知的聚烯大環內酯抗生素中是前所未有的，賦予了它顯著提高的水溶性和生物利用度。研究進一步揭示，Mandimycin 透過結合真菌細胞膜中的磷脂（尤其是磷脂醯肌醇）發揮殺菌作用，而不是像大多數聚烯大環內酯抗生素那樣靶向麥角固醇。這種獨特的多靶點結合能力不僅提高了其殺菌效力，也減少了產生耐藥突變的可能性，從而有助於對抗 MDR 真菌病原體。在動物實驗中，Mandimycin 顯示出良好的藥代動力學特性和較低的腎毒性，同時在多個小鼠感染模型中對 MDR 真菌病原體展現了強效的殺菌作用。研究表明，利用系統進化導向的天然產物發現策略能夠有效找到具有獨特作用機制和低毒性的抗真菌藥物。Mandimycin 的發現不僅為抗真菌治療提供了一個新的可能性，也為未來藥物開發提供了新的思路和方向。進一步的研究需要評估 Mandimycin 在臨床環境中的潛在療效和毒性，以及磷脂作為抗真菌藥物開發潛在靶點的可行性。
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