01
研究背景
Francis Crick在1979年曾提到，獲取立方毫米腦組織的精確連線圖和所有神經元的活動方式幾乎是不可能的。然而，隨著技術的進步，研究者們透過結合鈣成像與體積電子顯微鏡技術，逐步實現了這一目標。過去的研究主要依賴於單細胞實驗和電生理記錄，提供的資訊較為零碎。透過此次研究，科學家們不僅能夠詳細表徵細胞型別，還能繪製出皮層柱的突觸連線圖，並揭示與基因表達資料相關的細胞型別特異性抑制連線。這項研究為理解視覺空間資訊整合的新計算原則提供了見解，並揭示了興奮性神經元之間的連線原則。
這篇論文發表在《Nature》期刊上，由美國的The MICrONS Consortium（MICrONS聯盟，MICrONS是Machine Intelligence from Cortical Networks大腦皮層網路機器智慧的縮寫）完成。該聯盟是美國MICrONS計劃的實施者，而MICrONS計劃則是美國在腦科學領域的“阿波羅計劃”的一部分。本次發表在Nature上的研究主要集中在小鼠視覺皮層的功能連線組學。該研究透過結合體積電子顯微鏡（EM）和鈣成像技術，首次在立方毫米尺度上展示了小鼠視覺皮層的神經元功能與連線關係。研究中，科學家們對清醒小鼠在觀看自然和合成刺激時的約75,000個神經元進行了密集的鈣成像，並與包含超過20萬個細胞和5億個突觸的電子顯微鏡重建資料進行了共註冊。透過對部分神經元的校對，研究者們成功重建了完整的樹突結構以及區域性和跨區域的軸突投射。這些資料作為開放資源釋出，提供了資料檢索和分析的工具。
02
研究發現
這篇論文介紹了MICrONS聯盟建立的MICrONS功能連線組學資料集，該資料集透過對清醒小鼠在觀看自然和合成刺激時的初級視覺皮層（VISp）和更高視覺區域（VISrl、VISal和VISlm）中的約75,000個神經元進行密集的鈣成像，結合電子顯微鏡重建，包含超過20萬個細胞和5億個突觸。研究透過對一部分神經元的校對，重建了完整的樹突樹以及區域性和跨區域的軸突投射，對映到每個神經元的數千個細胞間連線。該資料集作為開放資源釋出，包含資料檢索和分析工具。伴隨的研究利用該資料集對細胞型別進行了全面表徵，繪製了皮層柱的突觸級連線圖，並揭示了可以與基因表達資料相關聯的細胞型別特異性抑制性連線。功能上，研究識別了資訊在視覺空間中整合的新計算原則，描述了新的神經元不變性型別，並結合結構和功能揭示了興奮性神經元在區域內和跨區域連線的一般原則。
研究發現透過結合體積電子顯微鏡和鈣成像技術，能夠在小鼠視覺皮層的立方毫米尺度上橋接神經元功能和連線性。研究透過鈣成像測量了興奮性神經元對視覺刺激的反應，並透過串聯切片透射電子顯微鏡（TEM）成像映射了相同立方毫米的連線性。使用可擴充套件的卷積網路和定製的計算系統，研究在3D中重建了神經元及其突觸連線，並進行了廣泛的校對以確保準確性。最終，研究將鈣成像和TEM資料共同註冊，以匹配神經元反應與神經元及其連線性。這種方法不僅揭示了視覺皮層中資訊整合的新計算原則，還為理解神經元連線的結構和功能關係提供了新的視角。
03
臨床意義
揭示神經迴路的功能與結構關係：該研究透過詳細的神經元重建和功能成像，揭示了視覺皮層內和跨區域興奮性神經元間的連線原則。這為理解大腦如何整合和處理視覺資訊提供了新的視角。 促進神經元型別的鑑定：透過詳細的形態學和突觸資料，該研究提出了新的細胞型別鑑定方法，能夠識別僅憑形態難以識別的細胞型別。這有助於改進神經元分類和功能分配的研究方法。 推動神經疾病研究：瞭解神經元之間的連線模式及其功能響應可以幫助理解特定腦區在疾病狀態下的功能變化。這對於開發針對神經退行性疾病、精神疾病的診斷和治療策略具有重要意義。 支援人工神經網路發展：該研究利用人工神經網路模型來預測神經活動，揭示了視覺皮層計算的背景互動和不變性機制。這一功能性數字模型有助於模擬和理解大腦的計算過程，為人工智慧的演算法改進提供靈感。 提供開放資料資源：透過公開資料和工具，研究者們可以更廣泛地開展神經科學研究，促進跨機構和跨學科的合作，加速腦科學研究的進展。 這項研究不僅豐富了對視覺皮層功能和結構的理解，也為未來神經科學研究提供了寶貴的資料資源和技術方法。
04
實驗策略
1. 實驗設計與資料採集： 鈣成像：在小鼠視覺皮層的多個區域進行高密度鈣成像，捕獲約75,000個神經元的活動。這些小鼠在清醒狀態下觀看自然和合成的視覺刺激。 電子顯微鏡重構：將鈣成像資料與電子顯微鏡重構資料結合，重構約200,000個細胞及0.5億個突觸的連線。
2. 資料整合與分析工具： 資料共註冊：透過將鈣成像與電子顯微鏡資料進行共註冊，確保能夠將神經元的功能響應與其結構和突觸連線精確匹配。 開放資料資源：資料集作為開放資源釋出，提供用於資料檢索和分析的工具。
3. 細胞型別與連線性分析： 細胞型別的綜合表徵：利用結構和功能資料，全面表徵細胞型別，並揭示基因表達資料與特定細胞型別抑制性連線之間的關係。 連線原則的識別：識別興奮性神經元在區域內及跨區域連線的一般原則。
05
資料解讀
圖1：資源資料型別和資料產品
Figure 1 展示了在https://www.microns-explorer.org/網站上公開提供的九種資料資源及其之間的關係。 A. 為了展示公開提供的資料資源型別，作者列出了在https://www.microns-explorer.org/網站上可以獲取的九種資料資源。這些資源包括神經元形態、連線體資料、光學顯微鏡資料等，旨在為研究人員提供多樣化的資料支援。 B. 為了說明不同資料型別之間的關係，作者繪製了資料型別之間的關係圖。該圖展示了這些資料型別如何相互關聯和補充，以便於研究人員更好地理解和利用這些資料資源。 結論：圖1揭示了在https://www.microns-explorer.org/網站上提供的九種資料資源及其相互關係，為研究人員提供了豐富的資料支援和參考。
圖2：資料採集工作流程中的主要實驗步驟
Figure 2 展示了生成MICrONS資料集的主要實驗步驟的概述。 A. 實驗設計和結果：為了生成MICrONS資料集，作者首先進行了樣本準備，包括選擇合適的生物樣本並進行處理，以確保樣本的完整性和適合後續分析。 B. 實驗設計和結果：在樣本準備之後，作者進行了資料採集，使用高解析度成像技術獲取樣本的詳細結構資訊，為後續的資料分析提供基礎。 C. 實驗設計和結果：資料採集完成後，作者進行了資料處理和分析，應用先進的計算方法對採集到的資料進行處理，以提取有意義的生物學資訊。 結論：圖2詳細描述了生成MICrONS資料集的主要實驗步驟，包括樣本準備、資料採集和資料處理分析，為研究提供了系統化的資料獲取流程。
圖3：在體鈣成像資料
Figure 3 展示了透過在體鈣成像技術獲取的實驗資料，旨在分析小鼠在不同刺激條件下的神經活動。 a. 為了展示功能成像的體積，作者使用2P成像技術對小鼠的大腦區域進行了成像，白色區域表示區域邊界，紅色表示結構堆疊中的血管標記。 b. 為了展示結構2P堆疊中的平面註冊情況，作者提供了104個平面的線框表示。 c. 為了比較不同區域的深度，作者測量了後部（post.）和前部（ant.）註冊區域相對於腦膜表面的平均深度。 d. 為了展示功能掩膜在結構2P堆疊中的註冊位置，作者提供了一個3D散點圖。 e. 為了展示小鼠在實驗中所接受的五種刺激型別，作者提供了每種刺激型別的示例幀。 f. 為了展示神經元對重複刺激試驗的鈣活動，作者提供了三個神經元的去卷積鈣活動的光柵圖。 g. 為了分析神經元在Monet2試驗中的平均反應，作者展示了80個神經元在40次Monet2試驗中的去卷積鈣活動的試驗平均光柵圖。 結論：透過在體鈣成像技術，作者能夠詳細展示小鼠在不同刺激條件下的神經活動模式，為理解神經元的功能連線性提供了重要資料。
圖4：電子顯微鏡資料集
Figure 4 展示了電子顯微鏡（EM）資料集的結構和對齊質量，以及興奮性和抑制性突觸的例子。 A. 為了展示EM資料集與活體雙光子（2P）結構資料集的對齊情況，作者提供了一個俯檢視，其中血管結構以紅色顯示，GCaMP以綠色顯示。 B-C. 為了展示精細對齊的質量，作者提供了一個小區域的俯檢視，顯示了對齊的精確度。 D. 為了展示從軟腦膜到白質的覆蓋範圍，作者提供了一個單一切片的拼接圖。 E. 為了展示單一切片的細節，作者提供了圖D中切片的一個單一瓦片的例子。 F-G. 為了展示興奮性突觸的例子，作者在圖中用箭頭指示了這些突觸的位置。 H. 為了展示抑制性突觸的例子，作者提供了一個抑制性突觸的例子。 結論：該圖展示了EM資料集與2P結構資料集的對齊質量，並提供了興奮性和抑制性突觸的具體例子，驗證了資料集的精確性和全面性。
圖5：重建
Figure 5 展示了從電子顯微鏡（EM）影像中重建的錐體細胞的結構和連線情況。 A. 為了展示錐體細胞的形態，作者從電子顯微鏡影像中重建了一個錐體細胞。該圖顯示了細胞的完整結構。 B. 為了觀察錐體細胞在不同子體積間的分佈，作者展示了來自兩個子體積的錐體細胞，這些細胞跨越了子體積的邊界。 C. 為了驗證錐體細胞的準確性，作者從子體積65中選擇了78個經過校對的錐體細胞。這些細胞的選擇和校對過程確保了重建的準確性。 D. 為了展示錐體細胞之間的連線，作者在子體積65中發現了一對透過突觸連線的遠距離錐體細胞。這表明錐體細胞之間存在複雜的連線網路。 結論：透過電子顯微鏡影像的重建，作者展示了錐體細胞的形態、分佈及其複雜的突觸連線網路。
圖6：綜合分析資源與示例
Figure 6 展示了不同型別細胞的分類與分析方法，以及神經元與突觸的相關分析。 a. 為了展示非神經元細胞的分類，作者透過手動標註（深色輪廓）和分類器（無輪廓）對非神經元細胞進行了分類。 b. 為了對興奮性細胞進行分類，作者透過對形態特徵的無監督聚類進行了標記。 c. 為了對抑制性細胞進行分類，作者透過人類專家和訓練模型進行了分類。 d. 為了展示神經元與體內功能痕跡的匹配，作者將神經元註冊到體內功能痕跡中。 e. 為了展示子體積65中神經元的校對狀態，作者進行了校對狀態的分析。 f. 為了分析每個神經元的輸出突觸數量與對映到單個突觸後體細胞的比例，作者對圖e中的神經元進行了分析。 g. 為了展示一個完全校對的錐體細胞，作者展示了其突觸後體細胞位置，以彩色點表示。 h. 為了量化與不同類別突觸後細胞相關的突觸，作者進行了突觸的量化分析。 結論：透過多種方法對不同型別的細胞進行了分類和分析，並對神經元與突觸的關係進行了詳細的量化分析。
圖7：連線矩陣和分析
Figure 7 展示了不同型別神經元之間的連線關係及其突觸輸出的熱圖分析。 A. 為了分析興奮性神經元之間的連線，作者構建了校對後的興奮性神經元與其所有預測類別的興奮性突觸目標之間的連線矩陣。 B. 為了研究興奮性神經元與抑制性神經元之間的連線，作者構建了校對後的興奮性神經元與其所有預測類別的抑制性突觸目標之間的連線矩陣。 C. 為了探討抑制性神經元與興奮性神經元之間的連線，作者構建了校對後的抑制性神經元與其所有預測類別的興奮性突觸目標之間的連線矩陣。 D. 為了分析七個層次3錐體細胞的突觸輸出，作者繪製了一階和二階突觸輸出的熱圖。 結論：該圖透過連線矩陣和熱圖分析展示了興奮性和抑制性神經元之間的連線關係以及層次3錐體細胞的突觸輸出特徵。
06
主要結論
這篇刊登在《Nature》上的研究由美國MICrONS聯盟完成，旨在透過結合鈣成像和電子顯微鏡技術，深入瞭解小鼠視覺皮層的神經元功能反應及其電路架構。研究團隊透過在清醒的小鼠身上進行實驗，密集記錄了約75,000個神經元的鈣成像資料，這些神經元分佈在初級視覺皮層（VISp）和更高階的視覺區域（VISrl、VISal和VISlm）。此外，還透過電子顯微鏡重建了包含超過200,000個細胞和5億個突觸的資料集。
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討論總結
研究強調了該資料集在研究神經迴路結構與功能關係中的重要性。雖然電子顯微鏡被認為是識別突觸結構特徵的金標準，但MICrONS資料集提供的資訊遠不止於此，它揭示了細胞內的亞細胞結構以及非神經元細胞的細微形態。 此外，研究團隊討論了大型資料集的機會與限制。雖然大規模資料集提供了識別模式和趨勢的機會，但它們也帶來了分析上的挑戰，如自動分割的精度問題和資料質量的技術限制。 研究團隊指出，儘管完整的功能-結構圖譜的實現尚需時日，但該資料集為理解視覺皮層中複雜計算的結構-功能關係奠定了基礎。透過進一步的機器學習和校對，這一目標有望在未來實現。
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