近日，美國哈佛大學團隊研發出一種使用 CMOS 工藝製造的微孔電極陣列，其能用於並行細胞內記錄，從而用於突觸連線對映。當將這一陣列和微孔-神經元介面以及電流鉗電子器件結合一起，能在大鼠神經元培養中實現 90% 的平均細胞內耦合率，從而能夠生成包含豐富突觸訊號的細胞內記錄資料。（注：CMOS 的英文是 complementary metal-oxide semiconductor，中文翻譯為互補金氧半導體）。
（來源：Nature Biomedical Engineering）
從這些資料中，研究人員提取出 2000 多個神經元中的 70000 多個合理的突觸連線，總體誤差率大約為 5%。對於體外大鼠神經元，CMOS 微孔陣列平均實現了 90% 的細胞內耦合率，在最好的情況下為 97%，平均細胞內記錄振幅和細胞內耦合持續時間大約是此前方法的五倍。
同時，它還可以在相同的神經元上恢復細胞內耦合，而採用更具侵入性的傳統奈米針陣列則很難實現這一效果。這種對映規模遠遠超過了任何其他電極技術能夠實現的規模。要知道 CMOS 奈米針陣列只能繪製大約 300 個突觸連線的，而低通量膜片鉗和突觸不敏感的微電極陣列的效果更差。
與此同時，本次 CMOS 微孔電極陣列的可用性和效能均優於 CMOS 奈米針陣列，它能將並行細胞內記錄變得簡單易用，並且仍能實現強大的突觸連線對映。
另外，它的微孔不僅更加容易製造，還可以廣泛使用。總的來說，這種規模的突觸連線性繪製以及表徵突觸連線的能力，讓人類朝著大規模神經元網路的功能連線性繪製邁出了新的一步。
日前，相關論文以《透過微孔電極陣列的並行化細胞內記錄來對映數千個神經元之間的突觸連線》（Synaptic connectivity mapping among thousands of neurons via parallelized intracellular recording with a microhole electrode array）為題發在 Nature Biomedical Engineering（IF 26.8）。
圖 | 相關論文（來源：Nature Biomedical Engineering）
哈佛大學 Jun Wang 是第一作者，哈佛大學樸洪坤（Hongkun Park）教授和韓德熙（Donhee Ham）教授擔任共同通訊作者 [1]。
圖 | 韓德熙（Donhee Ham）（來源：資料圖）
突觸連線對映的需求仍未得到滿足
長期以來，電極一直是瞭解神經元及其網路的視窗。一方面，膜片鉗電極具有細胞內記錄功能，可以高靈敏度地測量從一個到幾個神經元的小突觸訊號。
另一方面，微電極陣列（MEA，micro electrode array）可以在細胞外並行記錄許多神經元，但是它對於突觸訊號缺乏敏感性。
在微電極陣列類似的並行性條件下實現類似膜片鉗的細胞內靈敏度，可能為觀察和探究神經網路中大量突觸訊號開啟一扇新視窗，有助於繪製出該網路的突觸連線圖並明確其連線強度特徵，這也是神經科學領域長期以來的一個研究課題。
因此，細胞內神經元記錄的並行化一直是領域內所努力實現的目標。但是，事實證明它非常具有挑戰性。對於各種型別的非膜片鉗電極來說，就算使用單個神經元，也很難真正地檢測突觸訊號的細胞內記錄。
2020 年，該團隊透過在具有 4096 個記錄位點或畫素的 CMOS 電子晶片上開發垂直奈米針電極陣列，藉此在並行細胞內神經元記錄上取得了顯著進展。
在使用電流鉗同時進行電流注入和電壓記錄操作中，由 CMOS 電路操控的奈米針電極實現了細胞內記錄，從而能在單個畫素上檢測到突觸訊號，並且該陣列能夠支援並行操作。
當時，研究人員發現在最好的情況下，其能在 4096 畫素的細胞內記錄 1728 個體外大鼠神經元中，並藉此發現了 304 個突觸連線。而膜片鉗只能在細胞內記錄一到幾個神經元，因此這遠遠超出了膜片鉗的能力範圍。
儘管這一進展意義重大，但是這種 CMOS 奈米針陣列既不具備日常使用的便利性，也不具備並行細胞內記錄的流暢性。由於奈米針的製造過於困難，因此無法廣泛應用，而且當時這一裝置僅能實現 5.8% 的平均細胞內耦合率。雖然其效能是當時最先進的，但仍然遠遠不能滿足突觸連線對映的需求。基於此，研究人員開展了本次研究。
（來源：Nature Biomedical Engineering）
六個單孔晶片的平均細胞內耦合率為 58%
在本次研究中，研究人員由代工廠製造了這款 CMOS 晶片，在其表面上具有 64×64=4096 個鋁畫素焊盤，每個鋁焊盤用 2.6µm 厚的 SiO2/Si3N4 鈍化。
為了在每個焊盤上製造微孔電極，研究人員在鈍化層中蝕刻一個 1.2µm 深、10×10µm² 寬的阱，在阱中心蝕刻一個 1.4µm 深的孔，以便暴露下面的鋁金屬，並能針對 Pt/Ti 進行沉積。同時，他們在鉑表面的孔上電沉積鉑黑（PtB，platinum black），以便增加電極的表面粗糙度，進而增加其表面積和電導率。
研究人員表示，這種微孔電極的製造比垂直奈米針電極的製造簡單得多。同時，單個神經元就能針對微孔實現完全覆蓋，這能減少為了啟動和維持細胞內記錄所需的膜通透性電流注射量。
除了偶爾的脈衝之外，微孔陣列每畫素注入的電流大小，平均比奈米針陣列大約減少五分之四。這些減少的電流不僅能夠減緩電極的劣化，而且由於對於電解質造成的化學擾動較小，因此所產生的氣泡也較少，同時還能減少對於細胞的干擾。這在很大程度上解釋了微孔陣列細胞內耦合持續時間和速率能夠得到大幅提高的原因，也解釋了其重新獲得細胞內耦合能力的原因。
同時，研究人員還開發了每個畫素具有短路多孔電極的器件。單孔晶片每畫素電極分佈較小，而多孔晶片的每畫素電極分佈較寬，因此可以作為單孔晶片的襯底。
隨著向細胞內記錄的轉變，動作電位呈現正極性，其振幅增長了一到兩個數量級。實驗中，研究人員發現了一些小的突觸訊號，比如突觸後電位（PSP，postsynaptic potentials）和其他亞閾值事件。
儘管電流注射一直在持續進行，但是細胞內訊號最終還是在記錄軌跡中丟失，研究人員將記錄跡線中細胞內訊號的丟失視為細胞內偶聯的丟失。然後，他們將六個單孔晶片與體外大鼠神經元連線，並在大量畫素下進行這種細胞內記錄。
在前 20 分鐘的執行中，六個單孔晶片的平均細胞內耦合率為 58%，這遠遠超過了奈米針陣列的平均值。整個實驗執行時長超過 60 分鐘，六個單孔晶片的細胞內偶聯率平均達到 90%，最高達到 97%。
這六個單孔晶片的細胞內記錄質量也優於奈米針陣列。細胞內記錄的動作電位的平均幅度為 4.7 毫伏，細胞內耦合平均持續時間為 32 分鐘。
四個多孔晶片也都成功實現了大規模並行細胞內記錄，其平均細胞內偶聯率為 71%，持續時間為 13 分鐘，動作電位振幅為 0.9mV，這遠遠低於六個單孔晶片。
下圖 b 比較了單個單孔畫素和多孔畫素的記錄軌跡示例，而圖 e-h 則針對六塊單孔晶片和四塊多孔晶片的細胞內耦合速率、持續時間和動作電位幅度進行了比較。這些結果證實了單孔晶片中小電極分佈範圍的好處。
（來源：Nature Biomedical Engineering）
有趣的是，雖然多孔晶片在所有細胞內記錄指標上平均不如單孔晶片，但前者往往表現出相對較少的晶片間差異，從而在耦合持續時間和幅度上表現出畫素間的差異。
研究人員還進行了另一個對照實驗，旨在展示孔巢狀孔電極的可能優勢。為此，他們製備出另外三個單孔晶片，這些晶片的孔電極周圍沒有設定小阱。
完成製備之後，研究人員進行了三組全陣列範圍的細胞內記錄。在細胞內偶聯位點總數和細胞內偶聯強度等效能指標上，那些孔電極直徑 d′=5 微米並且孔電極巢狀於小阱中的單孔晶片，往往要比對照組的單孔晶片有著更好的表現。
例如，前者的細胞內偶聯強度平均約為兩倍，這表明孔的存在可以提高密封阻力。也就是說，與垂直奈米針電極相比，巢狀在孔中的單孔電極的改進，主要歸因於單孔電極的小範圍分佈。
如前所述，單孔晶片的細胞內耦合持續時間的顯著改善，是由於單孔電極被神經元完全覆蓋的可能性更高，因此電流鉗所需的電流注入更小、侵入性更小。然而，整體的小電流注入不是恆定的，而是變化的。
最初較大的電流有助於加速膜透性，以便快速獲得細胞內偶聯。而隨後較小的電流一方面用於維持獲得的透性從而維持細胞內偶聯，另一方面用於減緩電極劣化。然而，較大的初始電流不一定能保證細胞內耦合，稍後注入較小的電流可能會逐漸發生細胞內耦合。
AI 和神經形態計算均可從本研究受益
總的來說，大規模突觸連線和連線強度的繪製，可以使 AI 和神經形態計算等研究受益，並可能在篩選藥物對於神經網路的影響上找到生物醫學應用。而本次由 CMOS 驅動的微孔電極陣列為這種突觸連線對映提供了一條途徑。一方面它易於操作，另一方面它能夠對神經網路進行宏觀細胞內記錄。
透過在可插入大腦的三維絕緣棒陣列（而不是二維平面）上製造大量微孔電極，並將其應用於體內記錄，不僅可以增加每個神經元發現的突觸連線的平均數量，還可以將突觸連線結構與網路行為聯絡起來。透過簡單地增加電極數量，可以進一步增加每個神經元發現的突觸連線的數量。
雖然用於電流鉗制的整合放大器和電流注入器的數量無法像電極數量那樣很好地擴充套件，但可以利用開關矩陣技術，使用有限數量的有源電路來驅動更多的電極。不過，研究人員表示，此次展示的從全網路細胞內記錄資料繪製突觸連線的過程只是一個開始，未來他們還將基於大資料開發更加複雜的對映技術。
參考資料：
1.Wang, J., Jung, WB., Gertner, R.S. et al. Synapaptic connectivity mapapping among thousands of neurons via parallelized intracellular recording with a microhole electrode array. Nat. Biomed. Eng (2025).https://doi.org/10.1038/s41551-025-01352-5
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