01
研究背景
Meningomyelocele（MM），也被稱為脊柱裂，是人類中最常見的中樞神經系統結構缺陷，主要由於胚胎髮育早期神經管未能正常閉合所致。儘管葉酸補充已顯著降低了該病的發病率，但其在活產嬰兒中的發生率仍為1/3,000至1/10,000，並伴隨終身的神經運動障礙和較高的死亡率。及時的診斷可以為產前諮詢和治療選擇提供依據，包括終止妊娠、胎兒手術或出生後的手術。然而，儘管全球有超過2000萬人受到神經管閉合失敗的影響，其確切病因仍未完全明確。
動物模型研究已確定數百個與神經管缺陷（NTD）相關的基因，通常表現為部分外顯率，涉及頂-底極性或Wnt/PCP、Wnt/β-連環蛋白和DNA轉錄通路。儘管流行病學估計NTD的遺傳性為60-70%，但在人類中僅少數基因被確認為NTD的致病因素，這可能是由於遺傳異質性所致。常見單核苷酸多型性（SNPs）的累加效應被提出，尤其是在葉酸代謝基因MTHFR中，但透過22項不同關聯研究的薈萃分析僅顯示出適度的風險。遺傳突變如VANGL1/VANGL2、TBXT、CCL2和CELSR1在佇列研究中被識別，但僅佔少數病例。之前在自閉症和先天性心臟病等疾病中使用的新生突變（DNM）方法取得了成功，提示這些突變可能處於淨化選擇之下，這促使研究者採用三聯體方法進行更大規模的研究。
02
研究發現
這項研究發現約22.3%的患者攜帶可能導致基因破壞或有害的錯義突變，其中28%的變異被估計為增加了患病風險。研究發現，攜帶有害新生突變的187個基因共同定義了包括肌動蛋白細胞骨架和微管相關過程、Netrin-1訊號傳導和染色質修飾酶在內的網路。基因驗證顯示，這些突變在非洲爪蟾胚胎中導致部分或完全的功能喪失、訊號傳導受損和神經管閉合缺陷。結果表明，新生突變對脊髓脊膜膨出的風險有重要貢獻，並強調了人類胚胎髮育中神經管閉合所需的關鍵途徑。
研究發現脊髓脊膜膨出患者中有害新生突變的負擔顯著高於對照組，尤其是在可能導致基因功能喪失的突變（如移碼插入/缺失、終止增益和剪接供體/受體突變）方面。研究估計，約52.43%的此類突變可能增加脊髓脊膜膨出的風險。此外，研究還發現這些突變基因在蛋白質相互作用網路中高度互聯，尤其是在涉及極性上皮形態發生、神經細胞粘附、神經管閉合和訊號傳導的生物學途徑中，表明這些基因在神經管閉合過程中具有功能上的趨同。透過網路傳播分析，研究進一步識別了與人類脊髓脊膜膨出風險相關的功能模組，揭示了GTP酶介導的肌動蛋白細胞骨架組織、微管相關過程、染色質修飾酶、Netrin-1訊號傳導和脂質代謝等途徑的潛在致病機制。
03
臨床意義
診斷與篩查：研究結果支援在有腦脊膜膨出家族史或相關症狀的孕婦中進行新發突變的遺傳篩查，以便早期診斷和干預。 個性化治療：識別出的關鍵基因和通路可以為開發針對腦脊膜膨出的個性化治療方案提供新的靶點。 預防策略：基於關鍵通路的識別，未來可以制定更為有效的預防策略，可能包括營養補充和生活方式調整，以降低患病風險。 綜上所述，本研究揭示了新發突變在腦脊膜膨出中的重要作用，強調了關鍵基因和通路在疾病發生中的作用，為臨床診斷、治療和預防提供了新的視角和方法。未來的研究應繼續探索這些基因在不同人群中的普遍性及其與環境因素的相互作用。
04
實驗策略
1. 研究物件： 招募了851個需要出生時分流的脊髓脊膜膨出三人組（患者及其父母）和732個對照三人組。
2. 基因組測序： 對這些三人組進行了全外顯子組測序（WES），以識別新發突變。 研究還包括全基因組測序（WGS）以確認是否有未識別的遺傳變異。
3. 資料分析： 採用嚴格的質控和親緣分析，識別出高置信度的新發突變。 比較病例與對照之間的破壞性新發突變（如框移插入/缺失、終止增益和剪接供體/受體突變）的負擔。 估算突變對疾病風險的貢獻比例。
4. 功能驗證： 在爪蟾（Xenopus）胚胎中進行基因驗證，觀察功能喪失、訊號受損和神經管閉合缺陷的情況。
05
資料解讀
圖1：根據預測功能影響對新生突變（DNMs）進行分類及其在多發性骨髓瘤（MM）和對照組中的發生率
Figure 1 旨在分析新生突變在多發性骨髓瘤患者和對照組中的分佈及其功能影響。 A. 為了分析新生突變的功能影響，作者將DNMs分類為LGD（喪失功能突變）、D-mis（錯義突變）、D-mis-HC（高度約束錯義突變，由元預測器呼叫）、容忍錯義突變和同義突變。圖中展示了每位MM患者（左側三角形帶條紋部分）和對照組（右側）中的DNM發生率。面積代表每個功能類別中MM與對照組之間DNM發生率的比率。 B-C. 透過統計分析比較了MM和對照組中DNM發生率的比率，使用泊松率比（RR）計算所有基因（B，n=19,658）和受約束基因（C，n=3,060；pLI≥0.9）的比率。變異率透過與hg38編碼區總大小（59,281,518個鹼基對）歸一化計算理論發生率。 結論：研究揭示了新生突變在多發性骨髓瘤患者與對照組之間的分佈差異及其功能影響，尤其是在高度約束基因中的顯著差異。
圖2：多發性骨髓瘤（MM）和對照佇列中有害新生突變（DNM）的分析
Figure 2 分析了MM和對照組中有害DNM的分佈及其在蛋白質相互作用網路中的表現，探討了這些突變在MM中的潛在功能影響。 A. 為了比較MM和對照組中有害DNM的分佈，作者分析了單例（DNM出現在一個三聯體中）和雙例（DNM出現在兩個獨立三聯體中）有害基因（LGD或D-mis）的比例。結果顯示，五個雙例基因被註釋為不同的功能類別（LGD、D-mis-HC或D-mis）。 B. 透過蛋白質-蛋白質相互作用網路分析，作者展示了MM中有害DNM基因的相互作用。圖中顯示了至少有一個連線的基因；未連線的（孤立）基因在補充圖4中展示。節點顏色表示變異功能類別：LGD（紫色）、D-mis（淺粉色）和D-mis-HC（深粉色）。雙例基因用綠色邊框標識（三個雙例基因被展示）。邊緣厚度表示蛋白質相互作用的置信分數，定義在STRING資料庫中。 C-D. 作者透過引導抽樣生成了100,000個隨機網路，選擇基因集大小為108（即135個對照DNM基因的80%），以計算MM和對照佇列中的邊（相互作用）總數。圖C展示了100,000個引導抽樣網路中邊的數量密度。邊數越多表示網路連線越密集。圖D展示了在對照（綠色）和MM（黃色）基因集中具有0-10條邊的節點數量。點表示中位數，誤差條表示第一和第三四分位數。 E. 作者對與187個MM DNM基因重疊的基因進行了基因本體（GO）術語網路視覺化（GO富集分析）。功能相關的GO術語透過共同涉及的基因（小圓圈）連線。節點大小表示術語的顯著性。術語之間的連線程度（邊），透過ClueGO的kappa統計量表示。 結論：MM中的有害DNM基因在蛋白質相互作用網路中表現出顯著的連線性和功能富集，提示這些基因可能在MM的發病機制中發揮重要作用。
圖3：功能子模組及富集的生物學過程來自有害的DNM基因
Figure 3 為了研究在MM佇列中187個有害DNM基因的功能性，作者使用這些基因作為種子，透過網路傳播分析識別出功能子模組，並利用Leiden演算法進行聚類分析。 A. 作者使用Leiden演算法對從STRING資料庫獲取的共表達值進行聚類分析，識別出功能子模組。這些子模組是從MM佇列中187個有害DNM基因的傳播網路中提取的。五個子模組透過GO生物過程、KEGG或Reactome資料庫註釋，FDR值小於10^-5。功能術語註釋的FDR值小於10^-8的用淺紫色背景標出。 B. 作者展示了最顯著富集的GO生物過程，其中FDR值小於10^-8，涉及GTP酶相關的肌動蛋白細胞骨架和微管相關過程。FDR值以-log10尺度表示。 結論：透過對MM佇列中有害DNM基因的傳播網路進行分析，識別出多個功能子模組，並揭示了與GTP酶相關的肌動蛋白細胞骨架和微管相關過程的顯著富集。
圖4：損傷性DNM基因揭示九個突變基因的不同功能子模組
Figure 4 展示了九個突變基因的功能子模組，這些基因包括D-mis基因（TNK2, TIAM1, PLCE1, KDM1A和DNAH5）和LGD基因（WHAMM, NOSTRIN, SPEN和MINK1）。 A. 為了揭示九個突變基因的不同功能子模組，作者分析了D-mis基因和LGD基因的功能。結果顯示，這些基因在功能上屬於不同的子模組。 B. 為了研究TIAM1 H1149P患者突變對細胞結構的影響，作者使用鬼筆環肽對野生型和突變型細胞進行染色，觀察到TIAM1 H1149P突變導致絲狀偽足減少。實驗獨立重複了三次，比例尺為10μm。 C. 為了研究TIAM1 H1149P突變對RAC1活化的影響，作者使用FRET技術觀察到，與載體和野生型TIAM1相比，TIAM1 H1149P突變顯著降低了RAC1的活化。資料經過Kruskal-Wallis檢驗和Bonferroni校正的雙側Wilcoxon檢驗。 D. 為了研究PLCE1 E623Q突變對RHOA的影響，作者對GTP結合的RHOA進行了定量分析。結果表明，PLCE1透過其RAS GEF結構域間接影響RHOA，而不是直接作用。每個點代表一個獨立實驗，資料經過單因素方差分析和Bonferroni校正。 E, G, I. 在非洲爪蟾中，敲低spen、mink1和nostrin及whamm導致神經管開放。圖中展示了在晚期神經胚階段注射MOs的非洲爪蟾胚胎的背面檢視。 F, H, J. 為了量化神經褶間的平均距離，作者對敲低spen、mink1、nostrin和whamm的非洲爪蟾胚胎進行了pax3原位雜交。結果顯示，敲低這些基因顯著增加了神經褶間的距離，資料經過單因素方差分析和Tukey多重比較檢驗。 結論：本圖揭示了九個突變基因的不同功能子模組，並展示了這些基因突變對細胞結構和訊號通路的影響，以及在非洲爪蟾中的功能驗證。
06
主要結論
這篇發表在《Nature》上的研究探討了新生突變（de novo mutations，DNMs）在脊髓脊膜膨出（也稱為脊柱裂）中的作用。研究發現，在851個需要出生時分流的脊髓脊膜膨出三聯體中，約22.3%的個體存在可能導致基因破壞或有害錯義突變，估計其中28%的變異與疾病風險相關。研究確定了187個具有破壞性新生突變的基因，這些基因定義了包括肌動蛋白細胞骨架和微管過程、Netrin-1訊號傳導和染色質修飾酶在內的網路。基因驗證顯示，這些基因在Xenopus（爪蟾）胚胎中會導致功能部分或完全喪失、訊號傳導受損和神經管閉合缺陷。結果表明，新生突變對脊髓脊膜膨出風險有重要貢獻，並強調了人類胚胎髮育中神經管閉合所需的關鍵通路。
07
討論總結
研究討論了脊髓脊膜膨出作為一種複雜的遺傳疾病，其病因尚未完全明確。雖然葉酸補充減少了疾病負擔，但其病發機制仍不清晰。文章透過大規模評估新生突變對脊髓脊膜膨出風險的貢獻，發現這些突變在大約22%的病例中是致病的。研究強調了某些關鍵網路的存在，這些網路透過多種基因的相互作用對脊髓脊膜膨出病理有重要影響，這與全基因組模型相符。研究還表明，儘管在實驗動物中發現的神經管缺陷基因與人類中有所不同，但其涉及的通路可能具有高度相似性。未來的研究可以透過將人類新生突變引入脊椎動物模型或人類神經管幹細胞模型來進一步探索這一領域。文章指出，儘管研究未能解決大多數脊髓脊膜膨出病例的病因，但為理解其複雜的遺傳基礎提供了重要見解，併為未來的研究指明瞭方向。
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