01
研究背景
神經元之間的物理連線模式及其分子和功能特徵決定了大腦細胞網路的資訊處理能力。傳統上，電子顯微鏡（EM）因其奈米級解析度和全面的結構對比度，是唯一能夠進行密集連線組分析的技術。然而，EM在視覺化特定分子方面存在侷限，需要與光學顯微鏡結合以獲取分子資訊。光學顯微鏡在分子視覺化方面具有獨特優勢，但其解析度通常限制在幾百奈米，難以區分密集標記的細胞結構。因此，研究人員開發了LICONN技術，透過特定設計的水凝膠嵌入和擴充套件，結合深度學習的分割和連線性分析，將分子資訊直接整合到大腦組織的突觸級重建中。
光學顯微鏡在統一突觸級電路重建和深入的分子特徵描述方面具有巨大潛力。儘管如此，其解析度限制使得密集的細胞結構難以區分。LICONN透過工程化的高保真迭代水凝膠擴充套件方案，結合蛋白質密度染色和高速度的衍射極限讀出，實現了手動神經元追蹤和基於深度學習的細胞分割。該技術不僅展示了對細微神經結構的可追溯性，還實現了分子測量的同步進行以及單一突觸解析度的連線性分析。這項技術為生物實驗中大腦組織的突觸級表型分析提供了一種易於採用的方法。
02
研究發現
研究團隊開發了一種基於光學顯微鏡的連線組學技術（LICONN），透過結合特製的水凝膠嵌入和擴充套件技術，以及深度學習的分割和連線性分析，成功實現了哺乳動物腦組織的突觸級別重建。該技術不僅能夠在突觸級別上進行神經迴路的重建，還能同時獲取分子資訊，從而為生物實驗中的腦組織表型分析提供了一種易於採用的方法。
透過LICONN技術，研究人員能夠在光學顯微鏡下以奈米級解析度重建腦回路，並結合分子標記進行詳細的分子表徵。該技術克服了傳統光學顯微鏡在解析度和對比度上的限制，實現了對神經元細胞結構的高保真追蹤和分割，並透過與電子顯微鏡資料的比較驗證了其準確性。這一技術為神經科學研究提供了一種新的工具，能夠在不依賴電子顯微鏡的情況下進行分子資訊豐富的腦組織重建。
03
臨床意義
LICONN技術提供了一種新的、可廣泛應用的方法來研究腦組織的連線模式和分子特徵。它不僅能在較大的體積內實現高精度的結構和分子資訊整合，還能推動對神經疾病機制的深入研究和臨床診斷的改進。該技術有潛力在常規神經科學實驗室中普及應用，為進一步理解神經網路功能和病理提供了新的視角。
04
實驗策略
1. 水凝膠嵌入和擴充套件： 使用含丙烯醯胺(AA)的固定液對小鼠進行心內灌注，使細胞分子具備乙烯基殘基，然後與水凝膠共聚合。 透過加入含多功能環氧化合物（如甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA)和甘油三縮水甘油醚(TGE)）的溶液來廣泛地功能化蛋白質，為水凝膠錨定做好準備。 聚合可擴充套件的丙烯醯胺-丙烯酸鈉水凝膠，並透過加熱和化學變性來破壞機械凝聚力。
2. 免疫標記和蛋白密度染色： 在第一次擴充套件後進行免疫標記，以視覺化特定蛋白質。 使用蛋白密度染色（例如氨基反應性熒光團衍生物）來全面視覺化細胞結構。
3. 顯微成像與資料處理： 使用旋轉盤共聚焦顯微鏡進行成像，結合深度學習的分割演算法來分析和重建細胞連線。 透過自動化影像對齊和體積融合技術來實現無縫影像拼接。
4. 深度學習分割與驗證： 透過深度學習模型（如洪水填充網路(FFNs)）來實現對大體積資料的自動化分割。 透過與獨立的地面實況資料進行比較，驗證技術的準確性。
05
資料解讀
圖1：使用光學顯微鏡對哺乳動物腦組織進行密集連線組重建
Figure 1 利用光學顯微鏡技術對哺乳動物腦組織進行了密集的連線組重建，以揭示神經網路的複雜結構。 A. 為了展示哺乳動物腦組織的連線組結構，作者使用光學顯微鏡對腦組織切片進行了成像。透過高解析度的顯微成像，獲得了腦組織中神經元及其突觸連線的詳細影像。 B. 為了驗證光學顯微鏡在連線組重建中的有效性，作者對比了光學顯微鏡與其他成像技術（如電子顯微鏡）在解析度和資訊獲取上的差異。結果顯示，光學顯微鏡能夠提供足夠的解析度以識別神經元的突觸連線，同時具有更高的成像速度和更大的成像範圍。 C. 作者透過對多層腦組織切片的成像和資料整合，重建了一個三維的腦組織連線組模型。該模型顯示了神經元之間複雜的連線模式，並揭示了特定腦區內的網路結構。 結論：透過使用光學顯微鏡技術，作者成功地對哺乳動物腦組織進行了密集的連線組重建，揭示了神經網路的複雜結構，為進一步研究腦功能提供了基礎資料。
圖2：使用水凝膠擴充套件和深度學習對小鼠初級體感皮層進行高解析度成像
Figure 2 展示了透過水凝膠擴充套件技術和深度學習方法對小鼠初級體感皮層進行高解析度成像的結果。 A. 為了研究小鼠初級體感皮層的微觀結構，作者對小鼠初級體感皮層（II/III-IV層，396 × 109 × 22 µm³原始組織規模）進行了水凝膠擴充套件處理，擴充套件前體積為0.95 × 10⁶ µm³，擴充套件後體積為3.5 × 10⁹ µm³，擴充套件倍率約為16倍。透過FFN（Flood-Filling Networks）對密集重建的79個細胞進行了分析。右側展示了來自錐體神經元的樹突（左側面板頂部的框中），並透過深度學習預測了突觸分子bassoon（青色，突觸前）和SHANK2（洋紅色，興奮性突觸後）的分佈，以及與之突觸連線的軸突（底部）。比例尺為15 μm（左）；2 μm（右）。所有長度尺度和比例尺均指擴充套件前的生物尺寸。 結論：透過水凝膠擴充套件和深度學習技術，可以高解析度地重建和分析小鼠初級體感皮層的微觀結構，特別是突觸分子的分佈和神經元之間的連線。
圖3：抑制劑結合結構的比較及結合口袋殘基的作用
Figure 3 展示了利用免疫標記技術來識別和分析神經突觸中的特異性分子。這一部分的研究展示了透過結合光學顯微鏡與免疫標記方法，可以實現對突觸前和突觸後標記分子的視覺化和定位分析。 總的來說，研究團隊採用了兩種主要的免疫標記物：bassoon和PSD95。Bassoon是一種突觸前活性區支架蛋白，而PSD95是突觸後支架蛋白。在光學顯微鏡的高解析度下，bassoon的標記顯現出奈米級斑點狀結構，與結構通道中的蛋白質密集特徵相一致。相對的，PSD95標記的特徵更接近於圓盤狀，映象特徵與電子顯微鏡（EM）資料中化學固定標本中的特徵相似。透過測量距SHANK2的距離，研究發現其間平均間距約為154±19nm，與以往培養神經元上觀察到的資料相似。 研究還透過自動化算法系統識別出完整的突觸組合，進一步驗證了這種免疫標記的方法準確度。例如，透過結合FFN（洪水填充網路）分割的體積，研究還更深入地探討了特定神經結構（如多刺樹突）的結合之處。 此外，研究中還添加了多種突觸蛋白的免疫標記，包括MUNC13-1和RIM1/2，這些蛋白在突觸相關的結構通道中也有類似分佈。對於研究的分子連通性，這些細節使研究人員能夠基於分子特徵推斷神經之間的連線性。研究方法精確定位了神經元結構內的突觸分子裝置，幫助理解了突觸相關的分子機器及其功能。 這些發現為光學顯微鏡在神經連通組學中的應用提供了新視角，展示了其結合拉曼光學等手段可以精準識別神經突觸中的重要分子。結合對應的自動化檢測工具，提供了一種識別興奮性和抑制性突觸的可行方法。
圖4：連線性分析和基於深度學習的突觸檢測
Figure 4 展示了透過免疫標記和深度學習技術，對神經突觸連線性的分析及其自動化檢測進行的詳細研究。此部分的研究強調了如何利用深度學習來預測和識別神經突觸的精確位置，同時進行突觸連線性分析。 具體來說，研究團隊透過標記興奮性和抑制性突觸後位點的標記（SHANK2和gephyrin），結合自動化深度學習預測的方法，分析了在初級體感皮層中的樹突輸入密度。研究發現，在樹突上，SHANK2陽性輸入密度高於gephyrin陽性輸入，並且大多數突觸位於樹突棘頭上。 在分析樹突突觸數量時，結果顯示大多數的棘頭僅有SHANK2陽性的連線，而少數的只有gephyrin陽性的連線，或者兩個標記均無，但在結構通道中依然顯示出明顯的突觸密度（PSD）。樹突軸突通常與其樹突棘頭形成連線，而抑制性突觸則主要集中在軸突初始段（AIS）和樹突軸突的中心。 接下來，研究團隊採用了深度學習預測方法，透過訓練的卷積神經網路（CNN）模型預測突觸分子的分佈。研究中展示瞭如何使用這些預測來分析和描繪特定神經元的突觸輸入場以及輸出，並在無需額外免疫標記的情況下解析大規模神經連線資料。 透過這種結合深度學習的策略，研究顯著提高了突觸檢測的準確性，並能夠在大規模的神經元分割中對映分子定義的突觸連線。這為未來神經迴路的深入研究提供了一個強有力的工具。
圖5：LICONN在突觸連線性以外的應用
Figure 5 展示了LICONN（基於光學顯微鏡的腦連線組學）技術在突觸連線性之外的一些應用案例。具體來說，這部分研究探索了LICONN在識別和分析細胞型別、細胞亞結構和多種細胞特徵方面的應用。 首先，研究透過分子標記法識別抑制性中間神經元，如表達體抑素（SST）和KV3.1b電壓門控鉀通道的中間神經元。此外，結蛋白G標記用於確認和分析星形膠質細胞，顯示出錨定杆樣結構和裂隙。 研究接下來進一步探討了在軸突初始段（AIS）上的個別分子，如錨蛋白G的特定標籤與結構通道中蛋白密集特徵的相關性。特別的是，LICONN能夠分辨出髓鞘軸突，透過髓磷脂鹼性蛋白標記確認髓鞘的邊界。 關於初級纖毛，研究展示了透過標記乙醯化微管蛋白和腺苷酸環化酶3，可以識別不同細胞型別的纖毛，包括星形膠質細胞和神經元。不同細胞型別的纖毛長度也在這個部分進行了量化分析。 進一步的研究中，透過檢測心房連線素-43表明間隙連線的存在。此外，組合化的檢測機制結合了中樞興奮性突觸（預測的基於深度學習的bassoon和SHANK2定位）。 最後，研究展示了LICONN能跨區域繪製電連線，並準確識別多種細胞特徵。這種綜合性技術開拓了在腦部以及其他器官組織上高解析度研究的可能途徑。
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主要結論
這篇發表在《Nature》上的研究文章由來自奧地利的科研團隊完成，介紹了一種基於光學顯微鏡的腦連線組學技術，即LICONN。該技術透過整合工程化的水凝膠膨脹技術和深度學習演算法，首次實現了在光學顯微鏡下對腦組織的突觸解析度的重建。這種方法能夠在奈米級解析度下成像，並且能夠結合分子資訊進行突觸級別的重建。LICONN技術允許在生物實驗中對腦組織進行突觸水平的表型分析，具有廣泛適用性。
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討論總結
文章指出傳統的光學顯微鏡在解析度和成像能力方面的限制使其難以進行密集的突觸級別的電路重建。LICONN透過使用特製的水凝膠膨脹和深度學習分割技術，克服了這些限制，實現了高解析度的腦電路重建。此外，與電子顯微鏡（EM）相比，LICONN能夠直接結合分子資訊，這為理解神經元之間的化學和電連線提供了新的視角。 研究強調，LICONN技術不僅可以用於詳細的體積標註和自動化分割，還可以擴充套件到更大體積的腦組織分析。這項技術的廣泛可獲得性和易用性，使其成為非專業神經科學實驗室進行連線組學研究的一個有力工具，也為其他器官的高解析度組織分析提供了新的可能性。LICONN的創新在於它結合了結構與分子資訊，為哺乳動物大腦細胞的多模式描述提供了新的途徑，包括形態學、連線性、功能以及基因表達等方面。
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