01
研究背景
AMPAR在單毫秒時間尺度上允許陽離子流入突觸後神經元，這種快速去極化對大腦中的快速資訊處理至關重要。AMPAR訊號在大腦中透過不同組合的AMPAR亞單位GluA1–4和跨膜AMPAR調節蛋白（TARPs）調節，這些蛋白影響AMPAR門控動力學和突觸定位。AMPAR具有三個主要功能狀態：靜息、開放和去敏化。穀氨酸與配體結合域（LBD）結合後，AMPAR進入準備狀態：LBD的貝殼結構閉合在神經遞質周圍，但尚未發生適應啟用或去敏化的構象變化。AMPAR啟用發生在LBD二聚體耦合並透過對LBD-TMD聯結器施加張力開啟跨膜域（TMD）中的離子通道時，而去敏化發生在LBD仍與穀氨酸結合時，透過LBD二聚體解耦緩解LBD-TMD聯結器的張力，關閉離子通道門。由於AMPAR快速啟用，結構研究需要使用正變構調節劑（PAMs）來防止去敏化。沒有在僅有穀氨酸存在的情況下捕獲啟用的AMPAR，也沒有捕獲任何iGluR的啟用狀態。研究提出可以使用溫度作為工具捕獲穀氨酸啟用狀態，生理溫度增加AMPAR配體親和力，但也可能加速AMPAR門控動力學。研究顯示，AMPAR門控對溫度敏感，生理（37°C）和高熱（42°C）溫度增加受體的啟用機率。透過這一觀察，研究人員使用低溫電子顯微鏡捕獲了在37和42°C下製備的樣品中的穀氨酸門控狀態。穀氨酸啟用狀態與PAM啟用狀態不同。
這篇論文探討了α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸（AMPAR）亞型的離子型穀氨酸受體（iGluRs）在生理溫度下的穀氨酸門控機制。iGluRs是四聚體配體門控離子通道，主要介導興奮性神經傳遞。穀氨酸與iGluRs結合後，離子通道開放，陽離子流入突觸後神經元，啟動訊號傳導。然而，完整iGluRs的穀氨酸門控的結構機制尚不清楚。研究表明，AMPAR在生理溫度下的穀氨酸啟用增強。透過在這些溫度下製備AMPAR用於低溫電子顯微鏡，研究人員捕獲了穀氨酸門控機制。穀氨酸啟用引發離子通道開放，涉及所有離子通道螺旋遠離孔軸的鉸鏈運動，這一模式在所有iGluRs中保守。去敏化發生在區域性二聚體對解耦時，恢復通道鉸鏈並重新摺疊通道門，關閉離子通道。研究結果為理解穀氨酸如何門控iGluRs提供了基礎，並展示了生理溫度如何改變iGluR功能。
02
研究發現
研究發現，AMPAR在生理溫度下的啟用機率增加，穀氨酸結合後，離子通道的開啟涉及所有離子通道螺旋圍繞孔軸的鉸鏈運動，這種運動在所有iGluRs中是保守的。去敏化發生在區域性二聚體對解耦時，使離子通道關閉。研究透過冷凍電子顯微鏡捕捉了穀氨酸門控狀態，揭示了穀氨酸啟用狀態與正變構調節劑（PAMs）啟用狀態的不同之處，為藥物設計提供了基礎。
研究表明AMPAR的門控對溫度敏感，生理溫度（37°C）和高溫（42°C）都能增強受體的啟用機率。透過在37°C和42°C下進行冷凍電子顯微鏡實驗，研究捕捉到了穀氨酸啟用狀態的快照。穀氨酸啟用狀態與PAM啟用狀態不同，穀氨酸啟用時，LBD之間的啟用密封保持離子通道孔開放，所有四個離子通道螺旋在SYTANLAAF基序中以兩倍對稱的方式鉸鏈離開孔軸。去敏化發生在LBD啟用密封破裂時，放鬆對離子通道螺旋的拉力，關閉孔。研究結果為理解iGluRs的穀氨酸門控機制提供了新的基礎，並展示了生理溫度如何改變iGluR功能。
03
臨床意義
神經訊號傳遞的理解：該研究揭示了在生理溫度下，穀氨酸能夠顯著增強AMPAR的啟用機率，這對於理解腦中快速資訊處理的機制具有重要意義。AMPAR的快速去極化能力對於大腦的快速資訊處理至關重要，而對於這種機制的深入瞭解有助於解釋某些神經疾病中資訊傳遞的異常。藥物設計的啟示：由於研究揭示了穀氨酸在沒有正向變構調節劑（PAMs）情況下的獨特啟用機制，這為開發針對iGluRs的新型藥物提供了重要的結構基礎。這些藥物可能在治療神經退行性疾病、癲癇等與興奮性神經傳遞失調相關的病症中具有潛力。溫度對神經功能的影響：研究表明，生理溫度對iGluRs的功能有顯著影響，這強調了在研究神經受體功能時考慮溫度因素的重要性。這一發現可能對理解發熱、低溫等條件下的神經功能變化具有參考價值。穀氨酸啟用與脫敏機制：論文詳細描述了穀氨酸啟用狀態與脫敏狀態之間的轉變，這對於深入理解iGluRs在正常和病理條件下的功能調節機制具有重要意義。透過這些發現，研究不僅擴充套件了我們對穀氨酸受體功能的基礎科學理解，也為未來的臨床應用和藥物開發提供了新的視角和可能性。
04
實驗策略
1. 研究設計與目標：研究的主要目標是瞭解生理溫度如何影響AMPAR的穀氨酸門控機制。研究人員假設溫度能作為工具來捕捉穀氨酸啟用狀態，因為生理溫度會增加AMPAR配體的親和力和加速門控動力學。
2. 電生理實驗：透過溫度階梯（從25°C到42°C）記錄單通道電流，以觀察不同溫度下AMPAR的啟用頻率和幅度變化。使用的構建體為GluA2–γ2，這種構建體可以模擬突觸AMPA受體的功能。
3. 冷凍電鏡（cryo-EM）：在37°C和42°C下製備樣品，利用cryo-EM捕捉AMPAR在穀氨酸啟用下的構象狀態。透過訊號減法去除AMPAR的氨基末端結構域，聚焦於LBD和TMD進行三維分類和精煉。
4. 資料分析：透過cryo-EM資料處理，直接展示溫度對GluA2–γ2啟用機率的影響，並捕捉穀氨酸門控狀態的快照。
05
資料解讀
圖1：溫度增強AMPAR功能
Figure 1 旨在探討溫度對α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸受體（AMPAR）功能的影響，特別是GluA2–γ2單通道電流的變化。A. 為了研究溫度對GluA2–γ2單通道電流的影響，作者在25、30、37和42 °C下記錄了單個膜片上的GluA2–γ2單通道電流，使用10 mM穀氨酸作為激動劑。結果顯示，隨著溫度的升高，單通道電流的幅度增加。B. 透過電流直方圖和高斯擬合分析了不同溫度下的電流幅度事件，觀察到四個導電水平（12、35、45和65 pS）。C. 透過分析單通道膜片記錄，作者計算了不同溫度下的平均單位導電性。結果表明，隨著溫度的升高，單位導電性增加。D. 透過分析單通道膜片記錄，作者計算了不同溫度下的平均閉合駐留時間。結果顯示，隨著溫度的升高，閉合駐留時間縮短。E. 透過分析單通道膜片記錄，作者計算了不同溫度下的開放駐留時間。結果表明，隨著溫度的升高，開放駐留時間延長。F. 透過分析單通道膜片記錄，作者計算了不同溫度下的通道開放機率（PO）。結果顯示，隨著溫度的升高，通道開放機率增加。結論：研究結果表明，溫度升高能夠增強AMPAR的功能，具體表現為單位導電性增加、閉合駐留時間縮短、開放駐留時間延長以及通道開放機率增加。這些變化在25 °C和42 °C之間的差異具有高度顯著性（P值≤0.0001）。
圖2：在生理溫度下製備的GluA2–γ2的冷凍電鏡分析
Figure 2 展示了在不同溫度下製備的GluA2–γ2的冷凍電鏡結果，以研究其在不同條件下的結構狀態。a. 為了研究GluA2–γ2的結構，作者設計了一套樣品製備流程。該流程包括在42°C下進行樣品的預處理，並暴露於1 mM穀氨酸的條件下，以便觀察其在生理溫度下的結構變化。b. 作者展示了在42°C下預處理並暴露於穀氨酸後的AMPARs的冷凍電鏡微觀影像。該影像為後續的結構分析提供了基礎。c. 透過分析42°C樣品在有無穀氨酸條件下的二維分類，作者展示了不同條件下GluA2–γ2的結構差異。這些二維分類影像幫助識別了GluA2–γ2在不同狀態下的構象變化。d. 作者展示了在37°C（上）和42°C（下）條件下，新增穀氨酸後GluA2–γ2的結構快照。透過這些快照，可以觀察到溫度對GluA2–γ2結構的影響。e. 透過分析37°C（上）和42°C（下）條件下的整體顆粒群體，作者比較了這些顆粒在啟用狀態和失敏狀態（失敏-1和-2合併）下的分佈情況。結果表明，不同溫度對GluA2–γ2的狀態分佈有顯著影響。結論：透過在生理溫度下對GluA2–γ2進行冷凍電鏡分析，作者揭示了溫度和穀氨酸處理對其結構狀態的影響，提供了關於其啟用和失敏狀態的深入理解。
圖3：穀氨酸啟用
Figure 3 展示了GluA2–γ2複合物在穀氨酸啟用狀態下的結構特徵，重點分析了啟用橋的形成和離子通道孔的特性。A. 為了研究GluA2–γ2複合物在穀氨酸啟用狀態下的結構，作者展示了其整體結構，並透過插圖(i)和(ii)詳細展示了形成啟用橋的鹽橋。這些鹽橋在穀氨酸啟用過程中起到關鍵作用。B. 透過分析離子通道孔的孔徑分佈，作者比較了共識結構以及37°C和42°C啟用狀態下的孔徑變化。圖中用橙色線表示孔徑分佈，標記了關鍵殘基位置，並在右側標註了總體特徵。虛線表示水分子的1.4Å半徑，顯示了孔徑的相對大小。C. 為了詳細觀察穀氨酸啟用狀態下的對稱亞基對，作者展示了B和D亞基（左圖）以及A和C亞基（右圖）的特寫。(i)和(ii)分別放大顯示了B和D亞基以及A和C亞基中M3-S2–LBD的耦合情況，揭示了亞基間的相互作用。D. 為了更直觀地觀察穀氨酸啟用狀態下的離子通道孔，作者提供了一個自上而下的檢視，圖中顯示了旋轉90°後的四個亞基的排列情況。結論：圖3透過多角度展示了GluA2–γ2複合物在穀氨酸啟用狀態下的結構特徵，揭示了啟用橋的形成和離子通道孔的特性，為理解穀氨酸啟用機制提供了結構基礎。
圖4：穀氨酸啟用狀態與PAM啟用狀態的比較
Figure 4 比較了GluA2-γ2複合物在穀氨酸啟用狀態和PAM啟用狀態下的結構差異，重點關注離子通道孔徑的變化。a. 為了展示GluA2-γ2複合物在穀氨酸啟用狀態下的結構，作者排除了γ2亞基，展示了GluA2在穀氨酸啟用狀態下的構象。b. 為了展示GluA2-γ2複合物在PAM啟用狀態下的結構，作者同樣排除了γ2亞基，使用PDB 5WEO資料展示了GluA2在PAM啟用狀態下的構象。c. 透過比較活化狀態和O1或O2 PAM啟用狀態下的孔徑半徑剖面，作者發現了不同啟用狀態下離子通道孔徑的差異。虛線表示水分子的1.4-Å半徑。d. 比較了活化狀態和PAM啟用狀態下離子通道孔模型，分別展示了B和D亞基（左）以及A和C亞基（右）的結構差異。結論：透過比較GluA2-γ2複合物在穀氨酸啟用狀態和PAM啟用狀態下的結構，揭示了兩種啟用狀態下離子通道孔徑的變化，為理解其功能機制提供了結構基礎。
圖5：穀氨酸門控的結構機制
Figure 5 展示了穀氨酸結合後，離子通道在不同門控狀態下的結構變化，旨在揭示穀氨酸門控的結構機制。A. 為了分析不同門控狀態下的孔徑變化，作者繪製了每個門控狀態快照中的孔徑半徑曲線。結果顯示，孔徑在不同狀態下的變化情況，其中虛線表示水分子的1.4Å半徑。B. 為了比較不同門控狀態的結構變化，作者透過跨膜域（TMD）對每個狀態進行了疊加對齊。結果展示了各狀態的結構重疊情況。C. 為了定義穀氨酸結合引起的構象變化，作者對每個狀態中的單個配體結合域（LBD）進行了對齊。結果揭示了穀氨酸結合後引起的構象變化。D. 為了展示非對稱的LBD亞基位置，作者展示了相對的LBD對（B和A；D和C省略以提高畫質晰度），並在下方顯示了離子通道孔（所有亞基）。結果顯示了LBD亞基的非對稱位置。E. 為了分析區域性LBD二聚體對的變化，作者標記了每個門控狀態下的D1–D1和D2–D2距離標記殘基。結果顯示了不同門控狀態下的距離變化。F. 為了觀察LBD四聚體在不同門控狀態下的變化，作者從頂部視角（相對於E旋轉90°）展示了LBD四聚體。結果表明，在啟用過程中，LBD之間的啟用環發生擴張。結論：圖5揭示了穀氨酸結合後，離子通道在不同門控狀態下的結構變化，尤其是LBD的構象變化和啟用環的擴張，為理解穀氨酸門控的結構機制提供了重要線索。
06
主要結論
這篇發表在《Nature》上的論文揭示了AMPA亞型離子型穀氨酸受體(iGluR)在生理溫度下的穀氨酸門控機制。研究表明，穀氨酸能在生理溫度下增強AMPA受體的啟用狀態。透過低溫電子顯微鏡技術，研究人員觀察到，穀氨酸啟用導致所有離子通道螺旋向外鉸鏈運動，從而開啟離子通道。這種運動模式在所有iGluR中是保守的。去敏化發生在區域性二聚體配對解耦時，使離子通道關閉，並恢復通道鉸鏈和摺疊通道門。研究結果為理解iGluR的穀氨酸門控機制提供了基礎，併為藥物設計提供了新的視角。
07
討論總結
這項研究指出AMPA受體在結合穀氨酸後，透過一個預啟用中間體轉變為其他構象狀態。啟用是由LBD之間的D1-D1接觸促成的，這種作用在M3-S2聯結器上施加了張力，透過S鉸鏈（B和D亞基）和Lurcher鉸鏈（A和C亞基）開啟通道。去敏化時，LBD仍然結合穀氨酸，但LBD之間的D2-D2接觸允許M3-S2聯結器的張力鬆弛，關閉上部門，並在Q/R位點進行更細的收縮。研究強調生理溫度下AMPAR門控的增強，突出了調節大腦溫度的重要性以及研究iGluR功能時考慮溫度的必要性。最後，研究為利用溫度解決的低溫電子顯微鏡抓住在生理溫度下更高頻率出現的蛋白質狀態提供了新的思路。
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