01
研究背景
免疫系統中的巨噬細胞以其吞噬和消化外來入侵者——例如細菌和病原體——的能力著稱。作為身體的“清道夫”，巨噬細胞在感染髮生時負責吞噬細菌，並透過一系列複雜的細胞內過程將其降解。然而，儘管我們對巨噬細胞吞噬功能的防禦角色有所瞭解，但對被吞噬細菌的最終命運以及這些過程對巨噬細胞代謝的影響仍缺乏全面認識。近年來，免疫代謝學迅速發展，這一領域揭示了免疫細胞如何透過代謝重程式設計來適應和響應病原體的存在。不同於從環境中攝取營養的傳統觀念，一些研究提示巨噬細胞可能具備透過降解吞噬的細菌獲取營養的能力。這一發現為我們理解巨噬細胞在不同感染狀態下的代謝適應開闢了新的研究方向。
在這方面，區分活細菌與死細菌對巨噬細胞代謝的不同影響是一個關鍵課題。活細菌通常透過觸發宿主細胞的免疫訊號傳導路徑，特別是那些涉及病原體識別受體(Pattern Recognition Receptors, PRRs)的通路，來啟用特定的免疫反應。這對細胞的代謝需求和路徑也會產生顯著影響。然而，死細菌和其代謝產物如何同樣影響巨噬細胞的代謝路徑，卻鮮有研究。在微生物降解過程中釋放的代謝中間產物，是否以及如何被宿主細胞用於支援免疫反應尚屬未解之謎。透過進一步研究死細菌在免疫代謝中的角色，不僅可以加深我們對免疫系統功能的理解，還可能幫助開發針對免疫相關疾病的新型療法。法國波爾多大學的科研團隊在此背景下，探討了巨噬細胞在吞噬死菌後的代謝重組機制，為此領域提供了新的研究視角和解釋框架。
02
研究發現
研究發現，巨噬細胞透過吞噬體-溶酶體系統降解細菌，從中回收碳原子和氨基酸，這些物質被重新整合到多種代謝途徑中，如谷胱甘肽和伊他康酸的生物合成，滿足巨噬細胞的生物能量需求。研究還發現，微生物來源的營養物質的代謝回收受到雷帕黴素靶蛋白複合物C1（mTORC1）的調控，並與微生物的活力密切相關。死去的細菌富含環腺苷酸（cAMP），維持細胞內的腺苷酸池，啟用腺苷酸蛋白激酶（AMPK），從而抑制mTORC1。這種機制使得死去的細菌能夠更有效地支援巨噬細胞的生存，但相比活細菌，產生的活性氧（ROS）和白細胞介素-1β（IL-1β）分泌減少。
研究表明，巨噬細胞能夠透過吞噬細菌來獲取營養物質，這些營養物質被用於支援細胞的代謝需求和免疫反應。特別是，死去的細菌透過富集cAMP來調節巨噬細胞的代謝途徑，啟用AMPK並抑制mTORC1，從而減少ROS的產生和IL-1β的分泌。這一發現揭示了細菌活力與宿主代謝和免疫反應之間的關聯，提供了新的視角來理解吞噬細胞如何在細菌感染中調整其代謝和免疫功能。這些研究結果有望為免疫相關疾病的代謝干預提供新的策略。
03
臨床意義
免疫代謝調控：研究表明，巨噬細胞在吞噬死亡的細菌後，能更有效地進行代謝再迴圈，有助於巨噬細胞在營養匱乏的環境中存活。這一機制可能對調節免疫細胞在感染期間的功能具有重要意義，尤其是在資源有限的感染部位，巨噬細胞可以透過利用死亡細菌作為營養來源來維持其活性和功能。細菌活性與免疫反應：與活細菌相比，死亡細菌在巨噬細胞中引發的反應表現為降低的活性氧（ROS）產生和減少的白介素-1β（IL-1β）分泌。這提示在設計抗感染治療策略時，可以考慮如何透過調節細菌活性，進而影響免疫反應的強度和性質。mTORC1在代謝再迴圈中的作用：研究指出，mTORC1訊號通路在調節細胞對吞噬溶酶體中降解的死亡細菌產生的營養物質的利用方面起到關鍵作用。透過調控mTORC1，可能為調節巨噬細胞的代謝適應和免疫反應提供新的干預靶點。菌體代謝物作為潛在的治療靶點：研究發現，死亡細菌中特有的代謝物，如cAMP，可以透過調節細胞內AMP水平和AMPK活性，影響巨噬細胞的抗氧化反應和炎症反應。這為利用細菌代謝物開發新型抗感染藥物和疫苗提供了新的思路。總的來說，這項研究為理解巨噬細胞在感染和免疫反應中的代謝適應提供了新的視角，併為開發以免疫代謝為靶點的治療方法奠定了基礎。
04
實驗策略
1. 同位素示蹤實驗：研究人員使用穩定同位素標記的細菌追蹤吞噬體-溶酶體內細菌的降解過程，分析其提供的碳原子和氨基酸如何被再迴圈至不同的代謝途徑中。
2. 比較分析：透過比較用殺死的無毒大腸桿菌（KEC）和細菌細胞壁成分脂多糖（LPS）刺激的巨噬細胞，研究人員分析了細胞在代謝重程式設計方面的差異。RNA測序揭示了在KEC處理的巨噬細胞中，與代謝過程相關的基因表達上調。
3. 代謝通量分析：透過使用13C標記的葡萄糖培養細菌，研究團隊分析了巨噬細胞在吞噬標記細菌後代謝物的同位素分佈，評估細胞對細菌代謝中間體的利用。
4. 功能驗證：透過基因敲除和敲入實驗（如RagA基因的敲除和過表達），研究人員驗證了mTORC1訊號通路在調控細菌源性營養物質再迴圈中的作用。
5. 體內實驗：在小鼠模型中，透過注射標記的細菌，研究團隊觀察了巨噬細胞在體內的代謝再迴圈能力。
05
資料解讀
圖1：吞噬死亡細菌為巨噬細胞的線粒體呼吸鏈提供能量
Figure 1 研究了巨噬細胞吞噬死亡細菌後對線粒體呼吸鏈的影響，重點在於比較不同刺激條件下基因表達和代謝活動的變化。a. 為了比較巨噬細胞在不同刺激條件下的基因表達變化，作者進行了RNA測序分析。火山圖顯示，與LPS刺激的巨噬細胞相比，KEC刺激的巨噬細胞中顯著上調或下調的基因。深灰色點表示顯著增加（右側）或減少（左側）的基因，橙色點表示與代謝過程相關的基因。b. 為了研究KEC刺激後特異性增加的基因，作者將這些基因按功能（右圖）和蛋白家族（左圖）進行分類，發現這些基因與運輸活性相關。c. 為了比較LPS和KEC處理的巨噬細胞中差異表達的SLC基因，作者繪製了熱圖。圖中展示了轉運蛋白家族和轉運的氨基酸。d. 為了研究吞噬作用對代謝活動的影響，作者測量了在Cyto.D.處理下BMDMs的ECAR。結果顯示，在補充葡萄糖的最小培養基中，KEC、乳膠珠或LPS覆蓋的乳膠珠刺激30分鐘後，ECAR的變化。e. 為了進一步探討吞噬作用對線粒體呼吸的影響，作者在Cyto.D.處理下測量了BMDMs的OCR。結果顯示，在補充葡萄糖的最小培養基中，KEC、乳膠珠或LPS覆蓋的乳膠珠刺激30分鐘後，OCR的變化。f. 為了驗證吞噬作用對線粒體呼吸鏈的影響，作者在未處理Cyto.D.的條件下測量了BMDMs的OCR。結果顯示，在補充葡萄糖的最小培養基中，KEC、乳膠珠或LPS覆蓋的乳膠珠刺激30分鐘後，OCR的變化。結論：吞噬死亡細菌後，巨噬細胞的基因表達和代謝活動發生顯著變化，尤其是與代謝過程和運輸活性相關的基因上調，表明吞噬作用為線粒體呼吸鏈提供能量。
圖2：吞噬死亡細菌為巨噬細胞提供代謝中間體
Figure 2 研究了巨噬細胞吞噬死亡細菌後，如何利用這些細菌提供的代謝中間體。A. 實驗設計示意圖，展示了用於B和C實驗的實驗設計。B. 透過在trans-well小室中培養的骨髓來源的巨噬細胞（BMDMs），檢測巨噬細胞特異性總肽段（灰色）和重肽段（藍色）的數量。實驗組分別為與SILAC標記的殺死的細菌（SILAC-KEC）分開培養（插入）和接觸培養（孔內），處理時間為6小時。結果顯示，接觸培養的巨噬細胞中重肽段的數量顯著增加。C. 透過用concanamycin A處理的BMDMs，檢測巨噬細胞特異性總肽段（灰色）和重肽段（藍色）的數量。實驗組分別為與SILAC-KEC分開培養（插入）和接觸培養（孔內），處理時間為6小時。結果顯示，接觸培養的巨噬細胞中重肽段的數量顯著增加。D. 實驗設計示意圖，展示了用於E實驗的實驗設計。E. 在trans-well小室中培養的BMDMs，分別處理6小時或18小時，與完全標記的死亡U-[13C]標記的細菌分開培養（插入）和接觸培養（孔內），檢測代謝物的分數標記。結果表明，接觸培養的巨噬細胞中45種代謝物的同位素標記分數顯著增加。F. 在吞噬死亡的U-[13C]標記細菌後，BMDMs中指示的代謝物的分數標記。結果顯示，巨噬細胞中這些代謝物的同位素標記分數顯著增加。結論：死亡細菌的吞噬為巨噬細胞提供了代謝中間體，這些中間體在巨噬細胞中被有效利用。
圖3：RagA調控吞噬細菌的代謝迴圈
Figure 3 研究了RagA在巨噬細胞中對吞噬細菌代謝迴圈的調控作用。a. 透過免疫熒光實驗，作者在用LPS包被的FITC-乳膠珠或表達GFP的KEC刺激20分鐘的骨髓來源的巨噬細胞（BMDMs）中，檢測了LAMP1（溶酶體）和RagA的共定位情況。結果顯示，RagA與溶酶體標記物LAMP1在刺激後有顯著共定位。b. 同樣透過免疫熒光實驗，作者檢測了mTOR在用LPS包被的FITC-乳膠珠或表達GFP的KEC刺激20分鐘的BMDMs中的分佈情況。結果表明，mTOR與溶酶體標記物LAMP1在刺激後有顯著共定位。c. 透過免疫印跡實驗，作者檢測了在用LPS或KEC刺激後的不同時間點，BMDMs中總S6、磷酸化S6（p-S6）和4E-BP1的表達水平。結果顯示，刺激後這些蛋白的磷酸化水平發生了變化，Vinculin作為對照。d. 透過LC-MS分析，作者檢測了用SILAC-KEC處理6小時的RagAWT和RagAGTP/Δ BMDMs中的巨噬細胞特異性總肽段（左）和重肽段（右）的數量。結果表明，RagAGTP/Δ BMDMs中肽段的數量與RagAWT存在差異。e. 透過LC-MS分析，作者檢測了用完全標記的U-[13C]KEC處理6或18小時的對照組和RagAGTP/Δ BMDMs中的代謝物的分數標記情況。結果顯示，RagAGTP/Δ BMDMs中代謝物的同位素標記分數與對照組存在差異。f. 同樣透過LC-MS分析，作者檢測了用完全標記的U-[13C]KEC處理6或18小時的對照組和Cre+::RagAf/f BMDMs中的代謝物的分數標記情況。結果顯示，Cre+::RagAf/f BMDMs中代謝物的同位素標記分數與對照組存在差異。g. 透過熱圖展示了用KEC刺激6小時的對照組和RagAGTP/Δ BMDMs中代謝物丰度的變化（以對照組為基準的log2倍數變化）。結果顯示，RagAGTP/Δ BMDMs中某些代謝物的丰度顯著變化。h. 透過檢測細胞內谷胱甘肽（GSH）的水平，作者分析了用完全標記的U-[13C]KEC處理6或18小時的對照組和RagAGTP/Δ BMDMs的GSH水平。結果表明，RagAGTP/Δ BMDMs中GSH水平與對照組存在差異。i. 透過檢測GSH的分數標記情況，作者分析了用完全標記的U-[13C]KEC處理6或18小時的對照組和RagAGTP/Δ BMDMs的GSH標記情況。結果顯示，RagAGTP/Δ BMDMs中GSH的同位素標記分數與對照組存在差異。j. 透過檢測細胞內GSH的水平，作者分析了用完全標記的U-[13C]KEC處理6或18小時的對照組和Cre+::RagAf/f BMDMs的GSH水平。結果表明，Cre+::RagAf/f BMDMs中GSH水平與對照組存在差異。k. 透過檢測GSH的分數標記情況，作者分析了用完全標記的U-[13C]KEC處理6或18小時的對照組和Cre+::RagAf/f BMDMs的GSH標記情況。結果顯示，Cre+::RagAf/f BMDMs中GSH的同位素標記分數與對照組存在差異。結論：RagA在巨噬細胞中透過調控溶酶體與代謝物的相互作用，影響吞噬細菌的代謝迴圈。
圖4：細菌活性決定吞噬細菌的代謝迴圈
Figure 4 研究了細菌活性對吞噬細菌的代謝迴圈的影響，特別是在骨髓來源的巨噬細胞（BMDMs）中。A. 為了分析細菌活性對代謝物的影響，作者對處理了活EC或KEC 6小時的BMDMs進行了代謝組學分析，透過UHPLC-MS分析了172種代謝物，主成分分析結果顯示不同處理組之間的代謝物差異。B. 該圖左側展示了谷胱甘肽（GSH）生物合成途徑及其與其他代謝途徑的連線示意圖，右側的熱圖顯示了處理KEC或活EC 6小時的BMDMs中與GSH合成相關的代謝物水平變化。C-D. 為了研究細菌活性對細胞內代謝物濃度的影響，作者測定了處理如圖A所示的BMDMs中指定代謝物的細胞內濃度。結果以相對於靜息細胞的倍數變化表示，顯示了不同處理對代謝物濃度的影響。E. 透過檢測處理如圖A所示的BMDMs的ROS產生，研究了細菌活性對ROS水平的影響。F. 為了評估細菌活性對代謝標記物的影響，作者測定了在吞噬U-[13C]EC或U-[13C]KEC 6小時後的BMDMs中EC完全標記的U-[13C]-代謝物和U-[13C]-氨基酸的細胞內濃度及代謝物的分數標記情況。G. 為了研究細菌活性對巨噬細胞存活的影響，作者檢測了在AA缺乏的RPMI培養基中處理了EC或KEC並培養指定時間的巨噬細胞的存活率，並在有無NEAA和EAA混合物的條件下進行比較。H. 為了分析細菌活性對代謝物標記的影響，作者測定了處理如圖F所示的BMDMs中指定代謝物的分數標記情況。I. 為了研究細菌活性對炎症因子分泌的影響，作者測定了在AA缺乏的RPMI培養基中培養並用活EC或KEC刺激18小時的BMDMs上清液中的IL-1β濃度，並在有無NEAA和EAA混合物的條件下進行比較。結論：細菌的活性顯著影響吞噬細菌的代謝迴圈，進而影響巨噬細胞的代謝狀態、存活率及炎症因子分泌。
圖5：源自殺死細菌的cAMP維持巨噬細胞的抗氧化反應
Figure 5 探討了由殺死的細菌衍生的cAMP對巨噬細胞抗氧化反應的維持作用。A. 為了比較EC和KEC中代謝物濃度的差異，作者使用火山圖展示了在KEC相對於EC中顯著增加或減少的代謝物。結果表明，在KEC中有一些代謝物顯著增加，而另一些顯著減少。B. 為了研究細胞內細菌代謝物的丰度，作者對用U-[13C]標記的KEC或EC處理6小時和18小時的骨髓來源巨噬細胞（BMDMs）進行了分析。結果顯示，特定細菌代謝物在不同處理時間內的細胞內丰度有所不同。C. 為了研究AMP生物合成途徑中代謝物的標記分數，作者對用U-[13C]標記的KEC或EC處理6小時和18小時的BMDMs進行了分析。結果表明，AMP生物合成途徑中的代謝物標記分數在不同處理時間內有所變化。D. 為了檢測細胞內AMP濃度，作者對用活的EC或KEC處理6小時的BMDMs進行了測量。結果顯示，KEC處理組的AMP濃度與EC處理組相比有顯著差異。E. 為了檢測細胞內ATP濃度，作者對用活的EC或KEC處理6小時的BMDMs進行了測量。結果顯示，KEC處理組的ATP濃度與EC處理組相比有顯著差異。F. 為了研究蛋白質的磷酸化狀態，作者對用EC或KEC刺激的BMDMs進行了免疫印跡分析，檢測了總蛋白和磷酸化（p）-S6、4E-BP1和AMPK的水平。Vinculin被用作對照。結果表明，不同時間點的刺激對這些蛋白的磷酸化狀態有影響。G. 為了檢測Itaconate丰度、ROS產生和IL-1β濃度，作者對RagAWT或RagAGTP/Δ BMDMs進行活的EC或KEC刺激。結果顯示，Itaconate丰度、ROS產生和IL-1β濃度在不同基因型和處理條件下有顯著差異。結論：源自殺死細菌的cAMP透過影響代謝物丰度、AMP和ATP濃度以及蛋白質磷酸化狀態，維持巨噬細胞的抗氧化反應。
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主要結論
這篇發表在《Nature》上的研究文章探討了巨噬細胞在吞噬細菌過程中如何利用細菌作為營養源來調節免疫代謝反應。研究發現，巨噬細胞吞噬的細菌透過在吞噬溶酶體內降解後，可以為巨噬細胞提供碳和氨基酸，這些物質可以被回收並進入多種代謝途徑，如谷胱甘肽和伊他康酸的生物合成。同時，研究指出這種代謝回收由營養感應機制(mTORC1)調節，並與微生物的生存狀態密切相關。死細菌比活細菌更能促進這種代謝回收，支援巨噬細胞的存活，但會減少活性氧(ROS)的產生和白介素-1β的分泌。這些發現為理解吞噬微生物的命運提供了新的視角，並指出了一種與微生物活力相關的代謝物質如何觸發宿主的代謝和免疫反應。
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討論總結
這項研究揭示了巨噬細胞能夠將吞噬的細菌降解產物作為營養物質進行回收利用，從而支援自身的代謝需求，尤其在營養匱乏的環境中，這種機制顯得尤為重要。研究還發現，mTORC1在活細菌代謝物的回收過程中起到抑制作用，這可能是為了防止與病原體相關的有害分子擴散。文章提出，死細菌積累的環腺苷酸(cAMP)可以被轉換為腺苷酸(AMP)，啟用AMPK訊號通路，進而抑制ROS的產生。這一發現為巨噬細胞如何在細菌感染的情況下進行代謝重程式設計提供了新的思路，並可能為免疫相關病理學的干預策略提供理論基礎。整體而言，這篇研究揭示了巨噬細胞在面對細菌感染時的代謝適應性反應，並可能為開發新型抗感染藥物和疫苗提供了潛在的應用方向。
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