【一般來說，日本科學家紮實而不一定有創造性。但是，也有例外，少數很有創造性，也有少數補紮實的。這裡是不夠紮實的一個例子：快而髒】。
我們研究目的是鈣調激酶（CaMKII a 和b）與其他基因在睡眠中的關係，但發現日本科學家原文章用的方法不夠好，有不可重複的結果。
我們用經典的、嚴謹的、大家接受的方法能夠重複他們一半的結果、不能重複另外一半結果。
（日本科學家注入針對Camk2b的sgRNA在胚胎中進行遺傳改造的小鼠，認為它表現出最顯著的睡眠變化：這些小鼠在24小時內的睡眠時間減少約120分鐘。而我們透過常規基因靶向技術敲除Camk2b基因的小鼠，發現突變小鼠的基礎睡眠則未發生顯著變化）。
我們不認為日本科學家造假，而估計他們用的方法簡單粗暴，出結果快，但不乾淨（英文為quick and dirty），從而得到不可重複的結果。
鈣/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶IIα和β亞型在哺乳動物睡眠調節中的不同作用
楊蔚文1,2，石婧熠2，李成鋼1,2，楊靖群1，餘建軍1,2，黃娟1,2，饒毅1,2,#
1Chinese Institute of Brain Research, Beijing (CIBR), and Chinese Institutes for
Medical Research, Beijing (CIMR), Capital Medical University, Beijing, China.
2Laboratory of Neurochemical Biology, Peking-Tsinghua-NIBS (PTN) Graduate
Program, Peking-Tsinghua Center for Life Sciences, Academy for Advanced
Interdisciplinary Studies, PKU-IDG/McGovern Institute for Brain Research, School
ofLife Sciences; Department of Chemical Biology, College of Chemistry and
Chemical Engineering; School of Pharmaceutical Sciences at the Health Sciences
Center, Peking University, Beijing, China;
#通訊作者
摘要
睡眠在生物體中具有重要功能，但我們對其分子機制的理解仍然有限。在過去二十年中，包括鈣/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶II（CaMKII）α和β在內的多種蛋白激酶被認為與睡眠調節密切相關。在所有已知的小鼠基因突變體中，注入針對Camk2b的sgRNA在胚胎中進行遺傳改造的小鼠表現出最顯著的睡眠變化：這些小鼠在24小時內的睡眠時間減少約120分鐘。我們透過常規基因靶向技術敲除Camk2a或Camk2b基因的小鼠，重新評估了它們的睡眠表型。儘管Camk2a基因敲除小鼠的基礎睡眠有所減少，但Camk2b突變小鼠的基礎睡眠則未發生顯著變化。無論是Camk2a還是Camk2b的基因敲除，都顯著抑制了睡眠剝奪後的睡眠反彈，表明這兩種蛋白激酶在睡眠穩態中發揮了作用。綜上所述，CaMKIIα在基礎睡眠和睡眠穩態中均發揮重要作用，而CaMKIIβ主要在生理上調節睡眠穩態而非基礎睡眠，這呼籲睡眠領域在未來進行更加嚴謹的研究。
引言
遺傳學為我們理解睡眠調節的分子機制提供了重要幫助。小鼠的基因突變體在揭示特定基因在睡眠調節中的作用方面尤為重要。最著名的睡眠表型小鼠突變體或許是與食慾素及其受體相關的突變體，這些基因在維持白天清醒狀態中至關重要，功能喪失（LOF）突變的小鼠（或犬類和人類）則表現出典型的發作性睡病伴隨猝倒現象。另一個廣為人知的小鼠基因是Sik3，其功能獲得（GOF）突變被發現能夠增加睡眠。我們在SIK3功能喪失突變體中發現了減少的日間快速眼動（REM）睡眠，與SIK3功能獲得突變體的小鼠睡眠增多表型一致。然而，食慾素或SIK3的功能喪失突變體中睡眠減少的程度較為溫和：約為24小時內減少30分鐘。
與睡眠相關的其他蛋白激酶包括：蛋白激酶A、細胞外訊號調節激酶、腺苷酸單磷酸活化蛋白激酶、鈣調蛋白依賴性蛋白激酶II（CaMKII）α和β、c-Jun氨基末端激酶以及肝激酶B（LKB1）。其中，CaMKIIβ基因敲除小鼠顯示出最顯著的睡眠變化：在24小時內睡眠減少超過120分鐘。這一變化大於所有其他已知小鼠突變體的變化。因此，Camk2b敲除小鼠似乎是進一步研究睡眠調節的最重要的突變模型。我們構建了胚胎基因敲除小鼠，並在回交後測試了其睡眠行為，但未能驗證先前報告的功能快速篩查結果。
結果
透過傳統方法對Camk2a和Camk2b進行基因敲除
為了研究睡眠中的蛋白質磷酸化，我們構建了Camk2a和Camk2b基因敲除小鼠（圖1A,B）。儘管先前有研究透過胚胎注射單一引導RNA(sgRNA)來建立Camk2a和Camk2b的功能缺失突變體，以進行快速功能篩查，我們則採用了sgRNA定向基因編輯方法，建立了可遺傳的突變體，並進行了至少六代的雜交，再進行功能測試。我們刪除了Camk2a基因的外顯子5和6，這些外顯子編碼了氨基酸殘基92到137，並引入了一個移碼突變，將CCU（脯氨酸）替換為CUG（亮氨酸），導致後續的蛋白質亂序（圖1A）。該移碼突變覆蓋了先前文獻中刪除的所有氨基酸序列。我們還刪除了Camk2b基因的外顯子7和8，這些外顯子編碼氨基酸139到200，並引入了一個移碼突變，將GGGGUG（甘氨酸–纈氨酸）替換為GGGUGA（甘氨酸-*），同樣覆蓋了先前研究中刪除的所有序列。透過使用抗體檢測CaMKIIα和CaMKIIβ蛋白的Westernblot分析確認了在雜合突變小鼠和純合突變小鼠中Camk2a和Camk2b基因敲除的有效性（圖1C,D）。此外，CaMKIIα或CaMKIIβ敲除小鼠之間並未出現互補現象（圖1C,D）。作為行為學對照，我們在Morris水迷宮中測試了Camk2a和Camk2b基因敲除小鼠，確認它們存在缺陷（補充圖S1A,B）。
圖1|Camk2a和Camk2b突變小鼠的構建及其睡眠表型A用一對sgRNA介導Camk2a基因第5和第6外顯子刪除的示意圖，所用sgRNA序列為CTGGATCACGAAGACCCCTG和ACCTGAAGGTGAGTAACCCT。
B用一對sgRNA介導Camk2b基因第7和第8外顯子刪除的示意圖，所用sgRNA序列為TTGCAGTCACCTATGTCACG和TGTGTGAGGGGAAACACCTG。
C對Camk2a−/−、Camk2a+/−和Camk2a+/+基因型小鼠大腦裂解液中的CaMKIIα和CaMKIIβ進行Westernblot分析（每個基因型顯示4只小鼠）。對每個基因型的灰度值進行分析。
D對Camk2b−/−、Camk2b+/−和Camk2b+/+基因型小鼠大腦裂解液中的CaMKIIα和CaMKIIβ進行Westernblot分析（每個基因型顯示4只小鼠）。對每個基因型的灰度值進行分析。
E–J對Camk2a+/+（n=7，黑色曲線和條形圖）、Camk2a+/−（n=10，藍色曲線和條形圖）和Camk2a−/−（n=9，紅色曲線和條形圖）小鼠的睡眠進行分析。展示每小時清醒時間（單位：min/hr）的曲線。ENREM睡眠的曲線（F），或REM睡眠的曲線（G）。橫軸為Zeitgeber時間（ZT），白框表示光照期（白天），黑框表示暗期（夜晚）。分別展示24小時、白天和夜間的清醒時間（H），NREM睡眠時間（I），或REM睡眠時間（J）。
K–P對Camk2b+/+（n=11，黑色曲線和條形圖）、Camk2b+/−（n=12，藍色曲線和條形圖）和Camk2b−/−（n=16，紅色曲線和條形圖）小鼠的睡眠進行分析。展示清醒時間的曲線（K）、NREM睡眠的曲線（L）或REM睡眠的曲線（M）。分別展示24小時、白天和夜間的清醒時間（N）、NREM睡眠時間（O）和REM睡眠時間（P）。
ns，未達到顯著性；*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001和****p<0.0001；均值±標準誤（mean±SEM）。**雙因素方差分析（E，F，G，K，L，M）；單因素方差分析（C，D，H，I，J，N，O，P）。
未觀察到Camk2b−/−小鼠基礎睡眠的顯著變化
隨後，我們按照實驗室之前發表的方法分析了突變小鼠的睡眠表型。對於Camk2a敲除小鼠，儘管在總清醒時長（圖1E和H，補充圖S2A和S2B）、白天或夜間的非快速眼動睡眠（NREM）（圖1F和I，補充圖S2E和S2F）中未觀察到顯著變化，但白天和夜間的快速眼動睡眠（REM）時間分別減少了25.5分鐘和9.7分鐘（圖1G和J，表1，補充圖S2I和S2J）。這些變化與先前報道的24小時內約50分鐘的總REM睡眠時長相比，並無顯著差異。
然而，在分析Camk2b敲除小鼠的睡眠表型時（圖1K–P，表2，補充圖S2C、S2D、S2G、S2H、S2K、S2L），未觀察到睡眠模式的顯著變化：無論是總清醒時長、總睡眠時長，還是白天或夜間的NREM睡眠或REM睡眠均未發生顯著變化。
Camk2a和Camk2b在睡眠穩態中的作用
我們還進行了睡眠剝奪（SD）實驗，並分析了在6小時SD後，突變小鼠的睡眠反彈情況。在Camk2a敲除小鼠中，未觀察到非快速眼動睡眠（NREM）反彈或清醒時長減少的顯著變化（圖2A, B）。在14到20小時後，發現REM睡眠反彈略有下降；然而，在SD後24小時，未觀察到顯著差異（圖2C）。在Camk2b敲除小鼠中，儘管在13到17小時後，累積的NREM反彈和清醒時長減少略有下降，但與野生型小鼠相比，SD後24小時的睡眠反彈未出現顯著差異（圖2D, E）。並且，累積REM反彈也未顯示出差異（圖2F）。
接著，我們分析了突變小鼠在SD前後NREM δ波功率密度的變化。在Camk2a+/+、Camk2b+/+、Camk2a+/−和Camk2b+/−小鼠中，NREM睡眠期間的δ波功率在SD後顯著增加（補充圖S3A–D），而在Camk2a−/−和Camk2b−/−小鼠中，NREM δ波功率密度未發生顯著變化（補充圖S3E和S3F）。這一結果表明，在Camk2a−/−和Camk2b−/−小鼠中，SD後的δ波功率的穩態反彈受到抑制，這與它們在穩態反彈睡眠時長上的減少相一致。
我們進一步檢查了CaMKIIα和CaMKIIβ活性是否受到SD的調節。CaMKIIα-T286和CaMKIIβ-T287的自磷酸化已知可作為其活性的指示。免疫印跡分析顯示，在6小時SD後，CaMKIIα和CaMKIIβ的蛋白質水平未發生顯著變化（圖2G, I和K），但CaMKIIβ-pT287磷酸化顯著增加（p = 0.0286）（圖2J），而CaMKIIα-T286磷酸化未發生顯著變化（圖2H）。目前尚不清楚，CaMKIIα-T286磷酸化未出現變化的原因是抗體的靈敏度不足，還是CaMKIIα-T286在大腦中磷酸化CaMKIIα總量中所佔比例較低，亦或是CaMKIIα磷酸化確實沒有發生變化。
討論
我們的研究結果表明，CaMKIIα參與基礎睡眠和穩態睡眠反彈的調控，而CaMKIIβ則主要參與穩態睡眠反彈的調節。我們未能重現先前關於CaMKIIβ在基礎睡眠調節中發揮作用的發現。正如預期，CaMKIIα和CaMKIIβ突變小鼠均表現出學習缺陷。我們的研究還強調了採用傳統的基因靶向技術並在靶向基因後回交多個世代的重要性。
對於先前結果和我們當前結果之間的差異，可以有多種解釋。作為一種數量性狀，睡眠不僅對遺傳背景敏感，還受環境因素的影響，如環境溫度、食物型別、社會條件和環境豐富度等；記錄裝置和手術方法的差異也可能影響表型。然而，如果這些因素的適度差異導致基礎睡眠差異接近2小時，這對該領域來說將是不利的。
另一種解釋是，儘管先前的研究透過胚胎注射sgRNA快速生成突變體並在同一代進行功能測試，我們則採用了傳統、可靠且廣泛接受的方法，通過幾代雜交產生穩定的突變體並在幾代後進行功能測試。雖然快速方法節省了時間，但我們的方法更為可靠，並且是絕大多數研究者使用的方法。
方法
小鼠品系
野生型C57 BL/6J小鼠（8-10周齡）購自北京維通利華實驗動物技術有限公司或中國腦研究所實驗動物資源中心。CaMKIIα和CaMKIIβ敲除小鼠透過CRISPR-Cas9基因靶向技術構建。對於Camk2a，小鼠gRNA序列設計為5′-CTGGATCACGAAGACCCCTG-3′和5′-ACCTGAAGGTGAGTAACCCT-3′，用於刪除第5和第6外顯子。對於Camk2b，小鼠gRNA序列設計為5′-TCTAGGACCTCCATGTTGGG-3′和5′-TAAGACCTGTGTGTGAGAGG-3′，用於刪除第7和第8外顯子。將Cas9表達mRNA與sgRNA混合物透過電轉染注入受精卵中，然後將受精卵移植到代孕母鼠的子宮中。F0和F1小鼠透過PCR基因分型以確保重組存在。Camk2a−/−小鼠的基因分型引物為5′-AGGGGACAGAGAGGGGTAAG-3′和5′-ACAGGGCAGCCTCAGTCTAA-3′。Camk2b−/−小鼠的基因分型引物為5′-CAGGCCTACGATGGAGATGT-3′和5′-ATCCTGGTGTCCACTTGCTC-3′。突變系經過至少5代的回交到C57 BL/6J背景，以排除可能的脫靶效應。
小鼠飼養
所有實驗程式均遵循相關指南，並獲得了中國腦研究所動物護理與使用委員會的批准。我們遵守了所有關於動物使用的倫理規定。小鼠維持在C57 BL/6J背景下。小鼠在12小時明暗週期下飼養，並保持在控制的溫度和溼度條件下。食物和水供給自由採食。所有實驗中使用的小鼠年齡為10-14周。
腦電圖（EEG）與肌電圖（EMG）記錄與分析
EEG和EMG資料的記錄與分析方法參考我們之前的研究20。在基礎睡眠狀態下，EEG和EMG資料記錄為期2天，取樣頻率為200 Hz，每個時段為4秒。EEG和EMG資料初步處理使用AccuSleep39軟體，然後在SleepSign中進行手動修正。EEG和EMG訊號被分類為清醒（快速且低幅度的EEG，高幅度且可變的EMG）、NREM（高幅度且1-4 Hz主導頻率的EEG，低EMG張力）和REM（低幅度且6-9 Hz頻率的EEG，EMG完全靜止）。狀態事件定義為至少連續三段統一的狀態時段。包含運動偽影的時段雖然納入了睡眠時長分析，但在後續的功率譜分析中被排除。對於功率譜分析，EEG資料進行快速傅立葉變換（FFT）分析。功率譜表示EEG訊號在24小時基線狀態下每0.25 Hz到總0-25 Hz的平均比率。NREM δ波功率密度表示每小時內delta功率密度（1-4 Hz）與總功率（0-25 Hz）之比。累積反彈表示與基線條件下相對ZT時間點比較，睡眠剝奪後累計時間的變化。透過比較睡眠剝奪後NREM δ波密度與基線在相同ZT時間點（ZT6-ZT12）的差異，計算睡眠剝奪前後的變化。對於每隻小鼠，睡眠剝奪後六小時的NREM δ波密度與基線進行比較。
Morris水迷宮
空間學習和記憶透過Morris水迷宮的隱匿平臺版本進行評估40,41。實驗使用一個直徑為150 cm的圓形水池，水池中加入不透明水（21 ± 2 °C），水深為35 cm，確保平臺不可見。水池被劃分為四個象限，逃生平臺固定放置在SE象限中心，位於水面下1 cm。資料收集透過連線到影像追蹤系統的數字攝像機進行。實驗的第一天，小鼠進行1分鐘的自由游泳。之後，小鼠每次實驗前提前1小時進入水迷宮房間適應環境。在連續6天的實驗中，小鼠每天進行四次實驗，每次實驗間隔30分鐘。小鼠從面對水池牆壁的位置開始，每次的起始位置隨機分配。小鼠最多有60秒時間找到平臺。若小鼠在60秒內到達平臺後，允許其在平臺上停留10秒。若小鼠在60秒內未能找到平臺，工作人員會輕輕引導小鼠到平臺上，並允許其停留15秒。分析小鼠到達平臺所需的時間。
睡眠剝奪
在連續2天記錄EEG和EMG訊號後，將小鼠置於新籠中，時間點為ZT0。透過輕觸或輕柔處理，保持小鼠在6小時的睡眠剝奪期間清醒，之後將其返回記錄籠並繼續記錄24小時。
腦樣品製備與免疫印跡
按照指定的ZT，快速解剖小鼠大腦，用PBS沖洗後立即用玻璃組織勻漿器在4 ml裂解液（50 mM Tris, 1.0% Triton X-100，pH 8.0，150 mM NaCl，0.1% SDS，0.5%去氧膽酸鈉）中勻漿，加入新鮮配製的蛋白酶和磷酸酶抑制劑（Roche）。勻漿液在冰上孵育20分鐘後，進行12,000 rpm離心20分鐘，收集上清液並稀釋4倍進行免疫印跡。
Western blot按照標準程式進行。使用的抗體根據廠家說明書的最佳濃度進行稀釋。本研究中使用的抗體包括抗-β-actin抗體（ab213262，Abcam）、抗-CaMKIIα抗體（#11945，Cell Signaling）、抗-CaMKIIβ抗體（ab34703，Abcam）、抗–磷酸化CaMKII（Thr286）抗體（#12716，Cell Signaling）、抗-CaMKII抗體（#4436，Cell Signaling）。使用ImageJ計算灰度值。
統計與重複性
所有統計分析均使用GraphPad Prism 9.0軟體進行。採用單因素方差分析（One-way ANOVA）比較三個以上組間的差異，並進行Tukey多重比較檢驗。非引數檢驗採用Kruskal-Wallis檢驗。對於不同處理組間的差異，採用雙因素方差分析（Two-way ANOVA），並進行Tukey多重比較檢驗。對於相同個體多次測量相同結果變數的情況，採用雙因素重複測量方差分析（Two-way RM ANOVA），並進行Tukey多重比較檢驗。資料以均值±標準誤（SEM）表示。在所有情況下，p值大於0.05被認為無統計學意義。
表1 |Camk2a基因敲除雄性小鼠在不同睡眠–覺醒狀態下的總時間
|
總時間
|
24小時(均值± SEM,分鐘)
|
光照期(均值± SEM,分鐘)
|
暗期(均值± SEM,分鐘)
|
|
|
睡眠
|
Camk2a+/+
|
603.0 ± 13.9
|
428.6 ± 7.9
|
174.4 ± 15.4
|
|
Camk2a+/−
|
579.1 ± 9.1
|
430.7 ± 7.2
|
148.4 ± 8.1
|
|
|
Camk2a−/−
|
570.3 ± 27.0
|
397.6 ± 14.7
|
172.6 ± 24.5
|
|
|
NREM
|
Camk2a+/+
|
528.3 ± 13.7
|
372.8 ± 7.4
|
155.5 ± 8.2
|
|
Camk2a+/−
|
516.0 ± 10.4
|
380.9 ± 5.7
|
135.1 ± 7.3
|
|
|
Camk2a−/−
|
529.7 ± 26.9
|
366.3 ± 11.5
|
163.4 ± 23.7
|
|
|
REM
|
Camk2a+/+
|
74.7 ± 2.7
|
55.8 ± 2.6
|
18.9 ± 2.0
|
|
Camk2a+/−
|
63.1 ± 3.3
|
49.8 ± 4.0
|
13.3 ± 1.3
|
|
|
Camk2a−/−
|
40.5 ± 6.6
|
31.3 ± 5.3
|
9.2 ± 2.4
|
|
|
清醒
|
Camk2a+/+
|
837.0 ± 13.9
|
291.4 ± 7.9
|
545.6 ± 15.4
|
|
Camk2a+/−
|
860.9 ± 9.1
|
289.3 ± 7.2
|
571.6 ± 8.1
|
|
|
Camk2a−/−
|
869.7 ± 27.0
|
322.4 ± 14.7
|
547.4 ± 24.5
|
表2|Camk2b基因敲除雄性小鼠在不同睡眠–覺醒狀態下的總時間
|
總時間
|
24小時(均值± SEM,分鐘)
|
光照期(均值± SEM,分鐘)
|
暗期(均值± SEM,分鐘)
|
|
|
睡眠
|
Camk2b+/+
|
578.4 ± 9.7
|
429.4 ± 6.3
|
149.0 ± 9.0
|
|
Camk2b+/−
|
587.3 ± 17.4
|
416.5 ± 9.6
|
170.8 ± 16.5
|
|
|
Camk2b−/−
|
562.8 ± 8.5
|
415.6 ± 6.0
|
147.2 ± 7.9
|
|
|
NREM
|
Camk2b+/+
|
503.1 ± 9.1
|
369.2 ± 5.6
|
133.9 ± 8.2
|
|
Camk2b+/−
|
511.6 ± 16.4
|
360.6 ± 8.7
|
151.0 ± 15.0
|
|
|
Camk2b−/−
|
492.2 ± 9.5
|
361.1 ± 6.7
|
131.1 ± 7.2
|
|
|
REM
|
Camk2b+/+
|
75.4 ± 2.3
|
60.3 ± 2.0
|
15.1 ± 1.5
|
|
Camk2b+/−
|
75.7 ± 2.8
|
55.9 ± 1.7
|
19.8 ± 1.7
|
|
|
Camk2b−/−
|
70.6 ± 2.8
|
54.5 ± 2.7
|
16.0 ± 1.2
|
|
|
清醒
|
Camk2b+/+
|
861.6 ± 9.7
|
290.6 ± 6.3
|
571.0 ± 9.0
|
|
Camk2b+/−
|
852.7 ± 17.4
|
303.5 ± 9.6
|
549.2 ± 16.5
|
|
|
Camk2b−/−
|
877.2 ± 8.5
|
304.4 ± 6.0
|
572.8 ± 7.9
|