隨著解析度的提升，冷凍電鏡技術在近些年已經成為了解析蛋白質結構的重要手段。
國家奈米科學中心研究員楊雨荷課題組的主要研究方向是透過結構生物學手段，解析抗原抗體相互作用機制，進而理解免疫系統的應答規律，並以此為指導新型疫苗設計、抗病毒藥物開發等課題。
為此，該團隊需要使用冷凍電鏡對各類不同亞型的病毒抗原和抗體複合物進行三維重構。
為了重構得到高分辨三維模型，研究人員通常需要花費數小時來採集目標樣品照片，從照片中挑選出近百萬個蛋白質顆粒並進行平均，才能達到消除噪聲、提高解析度的目的。
人們很難分辨單個顆粒屬於哪種複合物，尤其是不同病毒亞型的形貌差別很小，因此同一個電鏡載網上僅能同時搭載一種確定型別的複合物。
對於變種極多的病毒抗原，和免疫系統產生的大量不同種類的抗體而言，對它們的複合物進行逐個資料採集需要耗費大量的人力和時間。
基於這一背景，楊雨荷課題組提出了 DNA 奈米標籤的概念。利用可程式設計組裝的 DNA 奈米結構作為具有特殊形狀的標記物，標記每種複合物顆粒的種類資訊，使得資料處理演算法能夠根據 DNA 奈米標籤的形狀對蛋白顆粒進行自動分類，實現同一個電鏡載網上搭載多種不同型別的複合物。
這種多路成像的理念能夠極大地提高電鏡表徵的通量，加速病毒抗原和抗體複合物的篩選和表徵。
冷凍電子斷層成像是目前冷凍電鏡技術發展的新興領域。這一技術透過對一個特定區域進行不同傾轉角度連續拍照，實現目標三維模型重構的目的。
相比於傳統冷凍電鏡技術，冷凍斷層成像可以用於對細胞內原位結構的表徵，更能反應蛋白質複合物在細胞內的真實狀態。
然而，由於需要對目標連續拍照，每張照片的電子劑量又受到了進一步的限制，照片信噪比相比傳統技術更低。除此之外，細胞內環境充滿了各類複雜的蛋白質，這進一步使得目標顆粒的識別和定位變得更加困難。
面對這一挑戰，楊雨荷團隊認為襯度強、尺寸大、形狀特異性高的 DNA 奈米標籤有望在細胞原位精確指示目標顆粒位置，成為分析細胞原位環境中蛋白顆粒的重要工具。
日前，相關論文以《用於多路單粒子電子顯微鏡和原位電子冷凍斷層掃描的 DNA 奈米標籤》（DNA Nanotags for Multiplexed Single-Particle Electron Microscopy and In Situ Electron Cryotomography）為題發在 JACS Au[1]，該團隊博士生陳遠方、黃一倩是第一作者，楊雨荷擔任通訊作者。
圖 | 相關論文（來源：JACS Au）
總的來說，本次工作探索了 DNA 奈米標籤在輔助電鏡成像上的可能性。相關論文討論了 DNA 奈米結構作為奈米標籤的三項優勢。
其一，DNA 奈米結構是一種高度可程式設計的結構，利用現有的技術可以在奈米尺度精確設計出任意形狀的奈米結構。
其二，目前已經有大量論文證明，DNA 奈米結構可以很簡單地修飾不同的蛋白質及其他功能分子。
其三，DNA 奈米結構也被證明具有一定的穩定性，至少在冷凍制樣的時間尺度內可以保持自身結構的完整性。
在多路電鏡成像中，本次論文認為 DNA 奈米標籤可能會對蛋白顆粒的訊號造成干擾。為此，本次論文討論了去除這種訊號干擾的可能方法，包括在設計上拉遠 DNA 和蛋白之間的聚集，以及使用演算法削弱 DNA 結構的訊號等。
在原位成像方面，DNA 奈米結構如何進入細胞，並在細胞中遷移並最終到達目標位點是一項重大的挑戰。因此，本次論文著重論述了目前可能的實現方法，包括利用細胞跨膜運輸通道、直接跨膜遞送、原位表達 RNA 奈米結構等可能的實現手段。
DNA 奈米標籤在活細胞中的原位蛋白質的標記的實現，目前急需解決的是高效遞送和胞內遷移的問題。楊雨荷表示：“在推進這一概念實現的過程中，我認為我們應該採用“先通後優”的策略。先透過對現有的技術和成果的整合，在初期階段保證基本功能的實現。在驗證核心功能和路徑有效後，再進行最佳化效率、提高普適性的探索”
她繼續說道：“因為儘管我們已經做了儘量全面的設想和分析，有合理的論據作為支撐，但實踐的過程中往往還會遇到新的問題。目前來說，針對 DNA 奈米標籤原位標記蛋白質用於結構解析這一目的，我們已經在開展試驗進行探索。”
基於細胞冷凍斷層成像技術的標準化流程，透過聚焦離子束技術，他們從細胞中減薄得到一個 100nm-200nm 厚的“小薄片”，但是不能精準定位到細胞中感興趣的區域，這也使得下一步在減薄得到的“小薄片”中定位奈米尺度的蛋白質結構提高了難度。
基於此，課題組認為首先應選擇在細胞中丰度較高的蛋白質作為目標模版，進行 DNA 奈米標籤方法的探索。
另一方面，細胞內的內質網的膜結構在電子顯微鏡下具有較好的襯度，具有“電鏡低倍下可分辨性”。
綜上，如果以內質網上丰度較高的蛋白質作為 DNA 奈米標籤的標記目標，可以透過 DNA 奈米結構與內質網的“共定位”判斷 DNA 奈米標籤的功能性，同時證明胞內遷移這一問題是可以克服的。
由此，再進一步聚焦於探究 DNA 奈米標籤挑選蛋白質的重構策略，最終實現活細胞內原位蛋白結構的解析。
在 DNA 標籤的功能已經得到驗證之後，最後還需要從成本、簡便性和普適性的角度進一步最佳化，為製備細胞原位蛋白結構解析顆粒挑選的“通用型”試劑盒提供基礎。
歸根結底，DNA 奈米標籤技術是探索細胞內蛋白質在原位狀態下結構的工具。課題組探索的最終目的是透過 DNA 奈米標籤的輔助，利用冷凍斷層成像技術對蛋白質的結構進行解析，進一步認識和理解蛋白質發揮功能的機制，研究其構效關係，為人類改造自然和人工製造提供思路指導和借鑑。
總之，其所使用的工具是時有更迭的，是基於現有的成果和技術開發的一種探究手段，但對生命體機制的探索是永恆的話題。
下一步，他們計劃先設計不同形狀的 DNA 奈米結構，分別標記同一種病毒的不同抗原亞型，與抗體結合後使用電鏡觀察。驗證這種策略能否有效識別蛋白顆粒種類，並希望能夠重構得到正確的抗原抗體結合資訊。
參考資料：
1.https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacsau.4c00986
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