01
研究背景
哺乳動物的端粒由一種稱為shelterin的蛋白質複合物保護，shelterin中的TRF2亞基被認為透過形成稱為t-loop的結構來隱藏染色體末端，從而防止經典非同源末端連線（cNHEJ）的發生。cNHEJ是細胞修復DNA雙鏈斷裂的一種主要機制，但在端粒處不應發生以避免染色體融合。DNA-PK是cNHEJ的關鍵酶之一，它在端粒處的結合雖然必要，但並不啟動cNHEJ，這表明存在一種機制直接阻止了端粒處的末端連線過程。
在酵母中，Rap1直接結合端粒並保護其免受cNHEJ的影響，但在哺乳動物細胞中，RAP1是透過TRF2招募的，其在端粒保護中的具體作用尚不明確。研究表明，RAP1與Apollo核酸外切酶在抑制染色體末端的cNHEJ方面具有冗餘性。透過在小鼠和人類細胞中進行的實驗，研究發現RAP1和Apollo透過不同但同樣有效的途徑保護端粒免受cNHEJ的影響。研究揭示了RAP1透過與TRF2和DNA-PK形成複合物，阻止LIG4的招募，從而抑制DNA-PK在端粒處的末端連線功能。這一發現為理解哺乳動物細胞中單個線性染色體的維持提供了分子機制。
02
研究發現
研究揭示了在哺乳動物細胞中，染色體末端的保護是透過TRF2和RAP1與DNA-PK形成的複合體來實現的。RAP1透過與KU和DNA的相互作用網路，阻止DNA-PK招募LIG4，從而抑制其在端連線過程中的功能。這一機制在小鼠和人類細胞中均得到了驗證，表明RAP1與Apollo核酸酶在抑制染色體末端的經典非同源末端連線（cNHEJ）中具有冗餘作用。這種抑制作用防止了端粒融合，與依賴於3'突出端的機制並行工作。
透過生化實驗和冷凍電鏡分析，研究發現RAP1和TRF2與DNA-PK在端粒DNA末端形成了一個特定的複合體。RAP1的Myb和BRCT結構域分別與KU和DNA結合，阻止了LIG4的招募，從而抑制了cNHEJ的發生。這一機制解釋了DNA-PK在端粒結合和調節其切割而不啟用cNHEJ的現象，併為哺乳動物細胞中線性染色體的維持提供了分子基礎。
03
臨床意義
遺傳不穩定性與癌症：染色體末端不正確的連線和融合與多種癌症的發生相關。這項研究揭示了RAP1和TRF2在抑制這種不穩定性方面的具體機制，提示在癌症發生中可能的預防或治療策略。 細胞衰老與再生：研究表明，RAP1在衰老細胞中對抗cNHEJ的作用可能尤為重要，這提示了其在細胞衰老和組織再生中的潛在應用價值。 遺傳病的預防與治療：許多遺傳病可能與染色體結構異常有關。透過更好地理解RAP1和TRF2的保護機制，可能開發出新的治療策略，來預防或糾正這些遺傳問題。 總的來說，這項研究透過揭示細胞內染色體末端保護的分子機制，提供了可能的治療靶點和策略，對理解和治療與染色體不穩定性相關的疾病具有重要意義。
04
實驗策略
1. 研究背景： 研究關注端粒保護機制，特別是如何防止cNHEJ在端粒處的發生。 DNA-PK在端粒處的結合和重組調節已知，但其具體抑制機制不明。
2. 實驗設計： 生化實驗：透過生物化學方法和冷凍電子顯微鏡，研究RAP1和TRF2如何與DNA-PK相互作用以抑制其功能。 細胞實驗：使用小鼠和人類細胞，透過刪除Apollo和/或Rap1基因，觀察端粒融合情況，驗證RAP1在抑制cNHEJ中的作用。 結構分析：透過冷凍電鏡解析TRF2、RAP1和DNA-PK在端粒DNA上的結構，確定複合物的具體組成和功能機制。
3. 實驗方法： 熒光原位雜交（FISH）：用於檢測小鼠和人類細胞中染色體融合的頻率。 酶切足跡實驗：分析DNA-PK與telomeric模板結合的精確位點，研究TRF2和RAP1對其結合的影響。 蛋白質交聯實驗：驗證RAP1與KU之間可能存在的相互作用。 冷凍電子顯微鏡（cryo-EM）：重建RAP1、TRF2和DNA-PK複合體的三維結構，以確認其在端粒保護中的具體作用。 免疫沉澱實驗：驗證TRF2和RAP1如何阻止LIG4的招募。
4. 資料分析： 使用影像分析軟體對FISH結果進行定量。 透過冷凍電鏡資料重建複合體結構並進行結構解析。
05
資料解讀
圖1：RAP1和Apollo在小鼠和人類細胞中冗餘地防止端粒發生經典非同源末端連線（cNHEJ）
Figure 1 表明，RAP1和Apollo在端粒保護中起到關鍵作用，透過防止經典非同源末端連線（cNHEJ）來維持端粒的完整性。 A. 為了研究RAP1和Apollo在端粒保護中的作用，作者對Apollofl/fl Lig4+/+小鼠胚胎成纖維細胞（MEFs）進行單向導RNA（sgRNA）靶向Rap1和/或Hit&Run Cre的轉導，並在108小時後進行熒光原位雜交（FISH）分析。端粒透過Cy3-(TTAGGG)3（綠色）標記，DNA透過DAPI（品紅色）染色。結果顯示，白色和綠色箭頭分別標記了染色單體型和染色體型融合。 B-C. 透過熒光原位雜交（FISH）分析，作者檢測了在Apollo和/或RAP1去除後，LIG4存在或不存在的情況下，每個中期分裂相中涉及染色單體型（B）或染色體型（C）融合的端粒百分比。資料來自3個獨立實驗，每個實驗10箇中期分裂相（總n=30），並給出中位數。 D. 為了進一步驗證RAP1和Apollo在端粒保護中的作用，作者對TP53−/− RAP1+/+（RAP1也稱為TERF2IP）或TP53−/− RAP1−/− RPE-1細胞進行Cas9和對照sgRNA（sgControl）或sgAPOLLO的轉導，並在120小時後進行熒光原位雜交（FISH）分析。 E. 透過熒光原位雜交（FISH）分析，作者量化了在Apollo去除後，每個中期分裂相中融合的端粒百分比。資料來自3個獨立實驗，每個實驗10箇中期分裂相（總n=30），並給出中位數。使用普通單因素方差分析（ANOVA）進行統計分析，顯著性水平為*P ≤ 0.05, **P ≤ 0.01, ***P ≤ 0.001, ****P ≤ 0.0001；NS表示不顯著。 結論：RAP1和Apollo在小鼠和人類細胞中共同作用，防止端粒發生經典非同源末端連線（cNHEJ），從而保護端粒的完整性。
圖2：TRF2、RAP1和DNA-PK在端粒DNA末端形成終端複合物
Figure 2 研究了TRF2、RAP1和DNA-PK在端粒DNA末端的結合情況，旨在探討這些蛋白質如何與端粒DNA相互作用，形成終端複合物。 A. 為了研究TRF2、RAP1和DNA-PK在端粒DNA末端的結合情況，作者設計了DNase I足跡實驗。實驗中，32P標記的5′端用紅色星號標出。放射性標記的模板先與KU和DNA-PKcs孵育，然後加入由TRF1、TRF2、RAP1、TIN2、POT1和TPP1組成的shelterin複合物。DNase I消化的產物透過變性尿素聚丙烯醯胺凝膠電泳（urea-PAGE）進行分析。 B. 透過DNase I足跡實驗，分析了在DNA-PK和shelterin存在下形成的端粒末端結合複合物。結果顯示，shelterin複合物與DNA-PK共同作用，形成了特定的結合模式。 C. 透過DNase I足跡實驗，分析了在TRF2和RAP1存在下形成的端粒末端結合複合物。結果表明，TRF2和RAP1能夠共同結合端粒DNA末端，形成穩定的複合物。 D. 透過DNase I足跡實驗，分析了僅在TRF2存在下形成的端粒末端結合複合物。結果顯示，TRF2單獨能夠與端粒DNA末端結合，但結合模式與TRF2和RAP1共同存在時有所不同。 E. 透過DNase I足跡實驗，分析了僅在RAP1存在下形成的端粒末端結合複合物。結果表明，RAP1單獨與端粒DNA末端的結合較弱，結合模式不如TRF2或TRF2與RAP1共同存在時明顯。 F. 透過DNase I足跡實驗，分析了TRF2和RAP1與端粒或非端粒DNA的結合情況。結果顯示，TRF2和RAP1更傾向於與端粒DNA結合，而非端粒DNA的結合較弱。 結論：TRF2、RAP1和DNA-PK在端粒DNA末端形成了特定的終端複合物，TRF2和RAP1對端粒DNA的結合具有特異性，而DNA-PK的參與進一步穩定了該複合物。
圖3：與DNA-PK複合物形成需要三個不同的介面
Figure 3 探討了RAP1和TRF2蛋白與DNA-PK複合物形成所需的不同結構域和介面。 A. 為了展示RAP1和TRF2的結構域組織，作者提供了RAP1和TRF2的結構域示意圖，其中TRFH代表TRF同源域。 B. 透過DNase I足跡實驗，作者測試了RAP1 RCT或TRF2 RBM在端粒末端結合複合物中的必要性。實驗結果表明，這些結構域對於複合物的形成是必需的。 C. 透過DNase I足跡實驗，作者測試了TRF2的Myb域、基本域或同時缺失Myb和基本域（ΔMΔB）的影響。結果顯示，這些結構域的缺失影響了端粒末端結合複合物的形成。 D. 透過DNase I足跡實驗，作者在存在Teb1、RAP1或Teb1–RAP1的情況下測試了TRF2的必要性。結果表明，TRF2在這些條件下仍然是必需的。 E. 透過蛋白交聯分析，作者研究了在DNA存在下RAP1和KU的交聯情況。蛋白與交聯劑混合後，反應產物在變性tris-乙酸聚丙烯醯胺凝膠上分離，並透過銀染或免疫印跡分析。結果顯示，KU與RAP1的交聯物以及KU的二聚體和四聚體。 F. 透過DNase I足跡實驗，作者測試了RAP1的BRCT或Myb結構域在端粒末端結合複合物中的必要性。結果表明，這些結構域對於複合物的形成是必需的。 G. 透過DNase I足跡實驗，作者測試了透過與LIG4 BRCT域融合來拯救RAP1(ΔBRCT)的可能性。結果顯示，LIG4 BRCT域的融合能夠部分恢復RAP1(ΔBRCT)的功能。 結論：RAP1和TRF2的多個結構域對於與DNA-PK複合物的形成是必需的，且不同的結構域在複合物形成中扮演不同的角色。
圖4：RAP1–DNA-PK複合物的冷凍電鏡結構
Figure 4 展示了RAP1與DNA-PK複合物的冷凍電鏡結構，揭示了其各個蛋白域的相互作用和結合方式。 A. 為了確定RAP1–DNA-PK複合物的結構，作者使用冷凍電鏡技術獲得了複合電子密度圖。圖中不同的蛋白域以不同顏色標識，未著色的域未被視覺化。此圖展示了用於結構測定的蛋白示意圖，其中包括C端域（CTD）、FRAP–ATM–TRRAP域（FAT）、中部Huntington–EF3–PP2A–TOR1重複（M-HEAT）、N端Huntington–EF3–PP2A–TOR1重複（N-HEAT）和von Willebrand A域（vWA）。 B. 該圖展示了圖A結構中的一個子部分，顯示KU70 SAP域和RAP1 Myb域與DNA的結合情況。 C-D. 圖C展示了RAP1的BRCT域與KU70的vWA域結合的結構。圖D突出顯示了RAP1和KU的殘基，這些殘基介導了兩者之間的相互作用。 E-G. 透過DNase I足跡分析，作者檢測了不同RAP1變體（R133E、ΔBRCT和KR/DE）和KU變體（DE/KR）在端粒末端結合複合物中的作用。圖E展示了RAP1變體R133E的分析結果，圖F展示了ΔBRCT和KR/DE變體的結果，圖G展示了KU變體DE/KR的結果，圖中標記了5′端粒末端的核苷酸。 H. 冷凍電鏡模型顯示了RAP1 BRCT域與KU70和KU80的結合情況。圖中還疊加了來自蛋白質資料庫（PDB）結構7LT3的LIG4 BRCT域，分別展示了有（底部）和無（頂部）LIG4 BRCT域的結合情況。 結論：RAP1與DNA-PK複合物的冷凍電鏡結構揭示了RAP1的BRCT域與KU70和KU80的結合方式，並透過DNase I足跡分析驗證了不同變體對端粒末端結合的影響。
圖5：TRF2和RAP1透過直接阻止XRCC4-LIG4招募到DNA-PK上來防止經典非同源末端連線（cNHEJ）
Figure 5 展示了TRF2和RAP1在經典非同源末端連線（cNHEJ）中的作用機制。 A. 為了研究TRF2和RAP1對cNHEJ的影響，作者在體外實驗中檢測了XRCC4–LIG4複合物在DNA-PK上的招募情況。結果顯示，TRF2和RAP1能夠阻止XRCC4–LIG4複合物的招募。 B. 為了進一步驗證TRF2和RAP1的作用，作者透過免疫沉澱實驗分析了TRF2和RAP1與DNA-PK的相互作用。結果表明，TRF2和RAP1能夠直接與DNA-PK結合，從而阻止XRCC4–LIG4的招募。 C. 透過熒游標記實驗，作者觀察了在細胞內TRF2和RAP1對XRCC4–LIG4定位的影響。結果顯示，TRF2和RAP1的存在顯著減少了XRCC4–LIG4在DNA損傷位點的積累。 結論：TRF2和RAP1透過直接阻止XRCC4–LIG4複合物的招募，抑制了經典非同源末端連線（cNHEJ）的發生。這一機制揭示了TRF2和RAP1在DNA修復中的重要調控作用。
06
主要結論
這項研究揭示了哺乳動物細胞中染色體末端保護的一個新機制。研究發現，Shelterin複合物的組成部分TRF2和RAP1能夠形成一個與DNA-PK的複合物，直接抑制其在端粒上的末端連線功能，從而防止經典非同源末端連線（cNHEJ）的發生。具體而言，RAP1與TRF2結合後，透過與KU蛋白和DNA形成相互作用網路，阻止DNA-PK招募連線酶LIG4。這一機制在小鼠和人類細胞中都得到了驗證，表明RAP1和Apollo核酸酶在抑制染色體末端的cNHEJ方面具有冗餘功能。透過這種抑制作用，研究揭示了端粒保護的一個分子機制，解釋了哺乳動物細胞中單條線性染色體如何得以維持的過程。
07
討論總結
研究表明，TRF2和RAP1透過直接與DNA-PK形成複合物，阻止DNA-PK的末端連線功能，從而防止cNHEJ的發生。透過冷凍電鏡結構解析，該研究展示了RAP1的BRCT結構域如何透過直接阻止LIG4的結合位點，抑制DNA-PK的連線功能。這一發現提供了關於RAP1在染色體末端保護中作用的新見解，並闡明瞭在端粒上cNHEJ被特異性阻斷的機制。此外，研究還揭示了DNA-PK在哺乳動物細胞中如何被功能性解耦，以選擇性地調節雙鏈斷裂修復途徑。這些結果不僅解釋了DNA-PK在端粒結合和調節末端重塑的過程中為何不啟用cNHEJ，還擴充套件了理解DNA-PK在DNA修復中的角色。透過這些機制，RAP1作為一個保守的染色體末端成分，發揮了關鍵的抑制作用，確保了DNA-PK在染色體末端的保護和功能。
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