01
研究背景
血腦屏障是一個高度專業化的結構，旨在保護大腦免受血液中有害迴圈因子的侵害，並維持大腦的穩態。糖萼層是血腦屏障的重要組成部分，主要由蛋白聚糖、糖蛋白和糖脂組成，覆蓋在血管內皮的表面。儘管糖萼層是血液與腦血管之間的第一個接觸介面，但其在穩態和病理狀態下的組成和功能仍然知之甚少。
這項研究由斯坦福大學的科研團隊進行，探討了腦血管內皮糖萼層在衰老和神經退行性疾病中的失調對血腦屏障（BBB）功能的影響。研究發現，隨著年齡的增長和神經退行性疾病的發展，腦血管內皮糖萼層的組成發生顯著變化，特別是在一種密集O-糖基化的蛋白質類——粘蛋白結構域糖蛋白中表現出顯著的紊亂。這些變化導致了血腦屏障功能的失調，嚴重時可導致小鼠腦出血。透過使用腺相關病毒恢復腦內皮中的核心1型粘蛋白O-糖苷，可以改善老年小鼠的血腦屏障功能，減少神經炎症和認知缺陷。這些發現為衰老大腦內皮糖萼層的詳細組成和結構對映提供了依據，並揭示了糖萼失調對血腦屏障完整性和腦健康的重要影響。
02
研究發現
研究發現，隨著年齡增長和神經退行性疾病的發展，腦血管內皮糖萼層的組成和結構發生顯著變化，尤其是密集O-糖基化的粘蛋白結構域糖蛋白的異常。這種異常導致BBB功能失調，並在嚴重情況下導致小鼠腦出血。研究進一步表明，透過腺相關病毒恢復腦內皮的核心1型粘蛋白O-糖苷，可以改善老年小鼠的BBB功能，減少神經炎症和認知缺陷。這些發現為衰老腦內皮糖萼層的詳細組成和結構繪製提供了依據，並揭示了糖萼失調對BBB完整性和腦健康的重要影響。
研究透過電子顯微鏡觀察到老年小鼠的腦血管內皮糖萼層厚度和麵積顯著減少。RNA測序分析顯示，與年輕小鼠相比，老年小鼠腦內皮細胞中與糖基化相關的基因表達顯著失調，特別是與粘蛋白型O-糖苷生物合成相關的基因下調。透過流式細胞術和成像技術，研究確認了這些轉錄變化在細胞表面糖基化水平上的反映，發現老年小鼠腦內皮細胞表面粘蛋白結構域糖蛋白表達顯著減少。透過腺相關病毒介導的基因過表達，研究成功恢復了老年小鼠的BBB功能，減少了血管滲漏和神經炎症，改善了認知功能。這些結果表明，恢復腦內皮糖萼層的完整性可能是治療與衰老相關的中樞神經系統疾病的有效途徑。
03
臨床意義
血腦屏障功能障礙：研究結果顯示，衰老和神經退行性疾病中糖萼失調導致BBB滲透性增加，這是這些疾病中常見的病理特徵。尤其是粘蛋白域糖蛋白的減少與腦出血的風險增加直接相關。糖萼功能恢復的潛力：透過恢復糖萼組成，尤其是粘蛋白O-糖苷的合成，可以顯著改善BBB的功能。這一策略在實驗模型中顯示出減少腦內炎症和改善認知功能的效果，提示在臨床上可能對衰老相關神經退行性疾病有治療潛力。新的治療路徑：研究表明，透過基因治療手段恢復糖萼層的完整性，可能為提高BBB功能，減少與衰老相關的中樞神經系統疾病的發生提供新途徑。該研究為理解大腦老化和紊亂的分子機制提供了新視角，併為未來的治療策略開發奠定了基礎。透過改善糖萼的結構和功能，有望在臨床上減輕與衰老和神經退行性疾病相關的病理損傷。
04
實驗策略
1. 組織學和顯微鏡技術：利用透射電子顯微鏡（TEM）觀察年輕和老齡鼠腦內皮糖萼層的結構變化。
2. 基因表達分析：透過RNA測序分析年輕和老齡鼠腦內皮細胞的糖基化相關基因表達變化。
3. 糖萼成分分析：使用流式細胞術及熒光染色技術檢測糖萼的組成成分。
4. 基因操作實驗：利用腺相關病毒（AAV）介導的基因敲低和過表達技術，研究特定糖基化酶（如C1GALT1和B3GNT3）對BBB功能的影響。
5. 行為學測試：透過Y迷宮和恐懼條件反射實驗，評估基因操作對小鼠認知功能的影響。
05
資料解讀
圖1：腦內皮糖萼和糖基化的年齡相關變化
Figure 1 研究了年輕和老年小鼠腦內皮細胞糖萼厚度、面積及糖基化相關基因表達的變化。A. 圖示展示了血腦屏障（BBB）和腦內皮糖萼層的結構。圖中使用了相對尺寸來描述糖萼成分。B. 透過透射電子顯微鏡（TEM）觀察年輕（3個月大）和老年（21個月大）小鼠皮層毛細血管，使用硝酸鑭染色。結果顯示，隨著年齡增長，腦內皮細胞糖萼的形態發生變化。C. 透過定量分析，比較了年輕和老年小鼠的內皮糖萼厚度。結果顯示，老年小鼠的糖萼厚度顯著減小。D. 透過定量分析，比較了年輕和老年小鼠的內皮糖萼面積。結果顯示，老年小鼠的糖萼面積顯著減小。E. 火山圖展示了年輕（3個月大）和老年（19個月大）小鼠腦內皮細胞中差異表達的糖基化相關基因。結果顯示，隨著年齡增長，部分基因上調（紅色），部分基因下調（藍色）。F. 圖示展示了隨著年齡增長，腦內皮細胞中上調和下調的主要糖基化相關通路。G. 實驗方案展示了透過微血管成像和流式細胞術對腦內皮細胞進行糖和糖綴合物分析的過程。H. 透過免疫熒游標記，檢測了急性分離的微血管中黏蛋白結構域糖蛋白的表達和番茄凝集素（LEL，內皮標記物）的標記。結果顯示，隨著年齡增長，黏蛋白結構域糖蛋白的表達發生變化。I. 對H中的實驗結果進行定量分析，結果顯示，老年小鼠的黏蛋白結構域糖蛋白表達顯著降低。J-O. 透過流式細胞術測定年輕和老年小鼠機械分離的腦內皮細胞中不同糖類的中位熒光強度（MFI）。結果顯示，老年小鼠的硫酸乙醯肝素（J）、硫痠軟骨素（K）、透明質酸（L）、黏蛋白結構域糖蛋白（M）、α2,6-連線唾液酸（N）和α2,3-連線唾液酸（O）的表達水平發生變化。結論：研究發現，隨著年齡增長，小鼠腦內皮細胞的糖萼厚度和麵積顯著減小，糖基化相關基因和通路的表達發生顯著變化。
圖2：皮質血管和微血管中的糖萼和糖蛋白表達
Figure 2 研究了小鼠皮質血管和微血管中糖萼和糖蛋白的表達，重點關注了StcE(E447D)對糖萼厚度和糖蛋白表達的影響，以及在阿爾茨海默病和正常對照腦組織中的表達差異。A. 透過StcE(E447D)–AF647標記CD31+皮質血管，檢測了腔內粘蛋白結構域糖蛋白的表達。結果顯示，在CD31+皮質血管中成功標記了腔內粘蛋白結構域糖蛋白。B. 對圖A的定量分析表明，StcE(E447D)處理組的糖蛋白表達水平顯著高於對照組（n=4只小鼠每組，雙側t檢驗）。C. 使用透射電子顯微鏡（TEM）結合硝酸鑭染色觀察了StcE(E447D)或StcE處理24小時後小鼠皮質毛細血管的結構。結果顯示，StcE(E447D)處理組的毛細血管結構與對照組存在差異。D. 對StcE(E447D)或StcE處理的小鼠腔內內皮糖萼厚度進行了定量分析。結果表明，StcE(E447D)處理組的糖萼厚度顯著增加（n=3只小鼠每組，雙側t檢驗）。E. 對StcE(E447D)或StcE處理的小鼠腔內內皮糖萼面積進行了定量分析。結果顯示，StcE(E447D)處理組的糖萼面積顯著增加（n=3只小鼠每組，雙側t檢驗）。F. 在急性分離的微血管中，透過LEL標記檢測了C1GALT1的表達。結果表明，C1GALT1在微血管中成功標記。G. 對圖F的定量分析顯示，C1GALT1在急性分離的微血管中的表達水平顯著（n=4只小鼠每組，雙側t檢驗）。H. 在急性分離的微血管中，透過LEL標記檢測了B3GNT3的表達。結果表明，B3GNT3在微血管中成功標記。I. 對圖H的定量分析顯示，B3GNT3在急性分離的微血管中的表達水平顯著（n=4只小鼠每組，雙側t檢驗）。J. 分析了急性分離的微血管中StcE(E447D)與C1GALT1（藍色）或B3GNT3（紫色）表達之間的線性相關性。結果顯示，兩者之間存在顯著的線性相關性。K. 在阿爾茨海默病和年齡匹配的對照腦組織中，檢測了急性分離的微血管中C1GALT1和粘蛋白結構域糖蛋白的表達。結果表明，阿爾茨海默病腦組織中這兩種蛋白的表達水平發生變化。L. 對圖K的定量分析顯示，阿爾茨海默病樣本中C1GALT1和粘蛋白結構域糖蛋白的表達水平顯著低於對照組（n=8對照和10阿爾茨海默病樣本，雙側t檢驗）。M. 描述了粘蛋白型O-糖基化生物合成途徑。結果表明，在小鼠衰老、阿爾茨海默病和亨廷頓病的RNA-seq資料集中，腦內皮核心1粘蛋白型O-糖基化生物合成酶的轉錄水平普遍下調。結論：StcE(E447D)處理能夠顯著影響小鼠皮質血管和微血管中糖萼和糖蛋白的表達，並且阿爾茨海默病腦組織中相關蛋白的表達水平顯著下降。
圖3：AAV介導的C1galt1敲低及其對微血管通透性和完整性的影響
Figure 3 研究了透過AAV介導的C1galt1基因敲低對小膠質細胞微血管通透性和完整性的影響，以及StcE處理對腦血管的影響。A. 透過AAV介導的C1galt1敲低實驗設計，展示了實驗的整體流程，包括ITR（倒置末端重複序列）的使用。B. 在急性分離的微血管中檢測C1GALT1的表達和粘蛋白結構域糖蛋白的標記，結果顯示C1GALT1在微血管中表達。C. 對B中C1GALT1表達的定量分析，結果顯示敲低C1galt1後C1GALT1表達顯著下降（每組5只小鼠，雙側t檢驗；平均值±標準誤）。D. 對B中粘蛋白結構域糖蛋白標記的定量分析，結果顯示敲低C1galt1後粘蛋白結構域糖蛋白標記顯著減少（每組5只小鼠，雙側t檢驗；平均值±標準誤）。E. 在轉導了AAV-EGFP和AAV-miR-C1galt1的年輕小鼠皮質中檢測Sulfo-NHS-biotin的洩漏，結果顯示AAV-miR-C1galt1組小鼠皮質中有明顯的Sulfo-NHS-biotin洩漏。F. 在AAV-miR-C1galt1轉導小鼠的EGFP+皮質血管中觀察到Sulfo-NHS-biotin的洩漏（由白色箭頭指示），結果顯示AAV-miR-C1galt1組小鼠血管通透性增加。G. 對F中血管通透性的定量分析，結果顯示AAV-miR-C1galt1組小鼠血管通透性顯著增加（每組5只小鼠，雙側t檢驗；平均值±標準誤）。H. 使用48小時StcE處理的粘蛋白結構域糖蛋白降解實驗設計，展示了實驗的整體流程。I. 對StcE處理48小時的小鼠進行全腦Sulfo-NHS-biotin洩漏檢測，結果顯示處理後小鼠腦中出現淺色熱點和更高的整體訊號，表明血管通透性增加。J. 對I中皮質血管通透性的定量分析，結果顯示StcE處理組小鼠血管通透性顯著增加（每組4只小鼠，雙側t檢驗；平均值±標準誤）。K. StcE處理48小時的小鼠腦中出現出血現象。L. 對StcE處理48小時的小鼠腦膜和腦室中的腦出血進行H&E染色，結果顯示明顯的出血區域。M. 在急性分離的微血管中檢測StcE處理48小時小鼠的ROS訊號，結果顯示ROS訊號增強。N. 對M中ROS訊號的定量分析，結果顯示StcE處理組小鼠ROS訊號顯著增加（每組6-7只小鼠，雙側t檢驗；平均值±標準誤）。O. 透過透射電子顯微鏡觀察小鼠腦內皮緊密連線，結果顯示在用生理鹽水或StcE處理24小時後，StcE處理組小鼠出現異常的緊密連線（分離，紅色星號；不連續，紅色箭頭）。P. 對O中完整緊密連線的定量分析，結果顯示StcE處理組小鼠完整緊密連線顯著減少（每組4只小鼠，雙側t檢驗；平均值±標準誤）。Q. 透過質譜對微血管中CLDN5進行無標記定量分析，結果顯示StcE處理組小鼠CLDN5水平顯著下降（每組4-5只小鼠，雙側t檢驗；平均值±標準誤）。結論：AAV介導的C1galt1敲低和StcE處理均導致小鼠微血管通透性增加和緊密連線完整性下降，表明C1galt1在維持血腦屏障功能中具有重要作用。
圖4：C1GALT1和B3GNT3過表達模型及相關AAV構建的概述
Figure 4 展示了C1GALT1和B3GNT3在小鼠模型中的過表達情況，以及其對腦微血管和血腦屏障（BBB）功能的影響。A. 該圖概述了C1GALT1和B3GNT3的過表達模型以及相關的腺相關病毒（AAV）構建。此部分主要介紹了實驗設計和構建的基礎資訊。B. 為了檢測C1GALT1的表達，作者對急性分離的小鼠腦微血管進行了LEL標記。結果表明，C1GALT1在這些微血管中成功表達。比例尺為10微米。C. 對圖B中C1GALT1表達的定量分析顯示，實驗組與對照組相比有顯著差異。每組有5只小鼠參與實驗，資料透過雙側t檢驗分析，結果以平均值±標準誤表示。D. 為了檢測B3GNT3的表達，作者對急性分離的小鼠腦微血管進行了LEL標記。結果表明，B3GNT3在這些微血管中成功表達。比例尺為10微米。E. 對圖D中B3GNT3表達的定量分析顯示，實驗組與對照組相比有顯著差異。每組有5只小鼠參與實驗，資料透過單因素方差分析（ANOVA）和Dunnett’s事後檢驗分析，結果以平均值±標準誤表示。F. 對急性分離的小鼠腦微血管中的粘蛋白結構域糖蛋白標記進行了定量分析。結果顯示，實驗組與對照組相比有顯著差異。每組有5只小鼠參與實驗，資料透過雙側t檢驗分析，結果以平均值±標準誤表示。G. 在AAV轉導的小鼠全腦切片中檢測Sulfo-NHS-biotin洩漏情況。結果顯示，Sulfo-NHS-biotin在這些切片中有明顯的洩漏現象。H. 在AAV轉導的小鼠EGFP+皮質血管中觀察到Sulfo-NHS-biotin洩漏，箭頭指示洩漏位置。比例尺為50微米。I. 對圖H中Sulfo-NHS-biotin洩漏的定量分析顯示，實驗組與對照組相比有顯著差異。每組有5只小鼠參與實驗，資料透過單因素方差分析（ANOVA）和Dunnett’s事後檢驗分析，結果以平均值±標準誤表示。J. 該圖展示了在衰老和神經退行性疾病中血腦屏障（BBB）功能障礙的示意圖，強調了本文的新發現。研究表明，隨著年齡的增長，腦內皮糖萼層退化，從而導致BBB功能失調。恢復糖萼可能是恢復與衰老相關的疾病狀態下BBB功能的有效治療方法。結論：C1GALT1和B3GNT3的過表達可影響腦微血管的結構和功能，尤其是影響血腦屏障的完整性。恢復糖萼層可能是改善與衰老相關的血腦屏障功能障礙的潛在治療策略。
圖5：AAV-B3GNT3處理小鼠的行為測試和分子特徵分析
Figure 5 v
06
主要結論
這項研究揭示了血腦屏障（BBB）的腦內皮糖萼層在衰老和神經退行性疾病中發生嚴重失調。研究發現，密集O-糖基化的黏蛋白域糖蛋白在衰老和疾病狀態下顯著改變。這些改變導致BBB功能失調，嚴重時會在小鼠中引發腦出血。研究團隊透過使用腺相關病毒恢復腦內皮的核心1型黏蛋白O-糖基化，改善了老年小鼠的BBB功能，減少了腦內炎症和認知缺陷。這些結果為腦內皮糖萼層在衰老和疾病中的結構和組成提供了詳細的對映，並揭示了糖萼失調對BBB完整性和腦健康的重要影響。
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討論總結
研究指出，腦內皮糖萼失調是導致衰老和神經退行性疾病中BBB功能障礙的分子機制之一。研究觀察到在這些條件下，腦內皮黏蛋白型O-糖基化的保守下降，並證明這種修飾的減少會導致BBB滲透性增加和腦出血的易感性。透過腺相關病毒介導的腦內皮黏蛋白型O-糖基化酶的過表達，研究團隊恢復了BBB的完整性，減少了神經炎症的標誌物，並改善了老年小鼠的認知功能。這些結果表明，恢復腦內皮糖萼可能是對抗與年齡相關的中樞神經系統疾病中BBB崩潰的有效治療途徑。研究還強調了黏蛋白域糖蛋白對腦內皮糖萼層和BBB功能的重要貢獻，並指出這些糖蛋白的去除會廣泛破壞BBB的完整性，包括調節緊密連線、增加氧化應激和破壞其他重要的血管穩態路徑。進一步研究將有助於識別參與BBB調節的關鍵黏蛋白域糖蛋白及其作用的特定分子途徑。儘管該研究展示了過表達C1GALT1和B3GNT3的AAV治療能夠減少BBB的滲透性並改善腦健康，但這些有益效果的精確機制仍不清楚。透過限制血源性分子的不特異性攝取，這些治療可能有助於保護大腦免受有害迴圈因子的影響。然而，瞭解這些糖基轉移酶影響的分子途徑對於我們理解腦老化和年輕化至關重要。
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