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研究背景
ISR是未摺疊蛋白反應的重要組成部分，透過eIF2α-p誘導的事件鏈來重新程式設計翻譯。研究指出，雖然ISR在酵母和哺乳動物細胞中表現出相似的翻譯控制機制，但哺乳動物具有四種eIF2α激酶，而酵母只有一種。此外，研究還提到在急性和慢性內質網應激中，eIF2B活性和eIF2α-p水平的變化並不總是線性相關，這引發了對ISR翻譯重程式設計機制的新思考。研究的重點在於探討在沒有eIF2α-p誘導的情況下，eIF2B活性下降是否會引發與c-ISR相似的應激反應。
這篇論文探討了哺乳動物整合應激反應（ISR）的可塑性，尤其是與eIF2B活性下降相關的機制。傳統的ISR（c-ISR）透過eIF2α的磷酸化（eIF2α-p）來抑制eIF2B活性，從而減少蛋白質合成。然而，研究發現在人類疾病如白質營養不良中，即使沒有eIF2α-p的誘導，eIF2B活性仍然受損。研究團隊描述了一種新的應激反應機制，稱為分裂ISR（s-ISR），其特徵是不同於c-ISR的翻譯和轉錄程式。s-ISR依賴於eIF4E介導的上游開放閱讀框1的翻譯和ATF4 mRNA的穩定化，隨後改變了一些代謝基因的表達，以在eIF2B活性減弱時維持細胞的生物能量學。
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研究發現
研究發現了一種新的應激反應機制，稱為分裂ISR（s-ISR），與經典ISR（c-ISR）不同。s-ISR的特點是依賴於eIF4E的翻譯啟動，導致ATF4 mRNA的穩定化，並改變一部分代謝基因的表達（如PCK2），從而在eIF2B活性減弱時維持細胞的生物能量學平衡。研究表明，s-ISR和c-ISR在轉錄和翻譯程式上是不同的，s-ISR在沒有eIF2α-p增加的情況下，透過eIF4E-ATF4-PCK2軸來維持能量穩態。
研究表明，s-ISR和c-ISR在基因表達重程式設計上存在顯著差異。s-ISR依賴於eIF4E來調控ATF4的表達，而c-ISR則不依賴於eIF4E。此外，s-ISR在eIF2B活性降低的情況下會引發特定的代謝適應，這種適應在疾病相關的eIF2B突變（如白質營養不良症）中尤為明顯。研究還發現，s-ISR在中度低血糖等輕度應激條件下被啟用，而在嚴重應激（如完全葡萄糖剝奪）下則被c-ISR取代。這表明ISR在哺乳動物中具有更大的可塑性，能夠根據應激強度調整細胞反應。
03
臨床意義
這篇文章揭示了一種新的應激反應機制，稱為分裂整合應激反應（s-ISR），它與經典的整合應激反應（c-ISR）不同。s-ISR的發現具有重要的臨床意義，尤其是在理解和潛在治療某些神經退行性疾病如白質營養不良症方面。白質營養不良症是一種由於eIF2B活性下降所導致的疾病，而s-ISR的啟用與這種活性下降相關。這為開發針對這些病理的治療策略提供了新的方向。此外，s-ISR強調了應激反應的可塑性，表明細胞可以根據應激的強度和型別調整其反應，這有助於理解細胞如何在不同的病理條件下維持能量穩態。
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實驗策略
1. 細胞模型選擇： 使用小鼠胚胎成纖維細胞（MEFs）和小鼠胚胎幹細胞（ES細胞）作為主要實驗模型。 引入了有vanishing white matter disease (VWMD)相關eIF2Bε突變的小鼠ES細胞，以模擬人類疾病。
2. eIF2B活性抑制： 透過短髮夾RNA（shRNA）介導的eIF2Bε亞基（Eif2b5基因）敲低來抑制eIF2B活性。 比較eIF2B活性抑制與急性內質網（ER）應激誘導的eIF2α-p增加對細胞的影響。
3. 蛋白質翻譯和轉錄分析： 使用[35S]甲硫氨酸和半胱氨酸摻入實驗來測量蛋白質合成。 進行聚糖體分析和RNA測序（RNA-seq）以研究翻譯效率和轉錄組變化。 使用anota2seq軟體分析翻譯和轉錄的差異。
4. 分子和生物化學分析： 透過Western blot分析關鍵蛋白（如ATF4、GADD34、CHOP）的表達。 使用免疫熒光染色觀察應激顆粒的形成。 進行生物能量學分析以評估細胞在不同應激條件下的代謝變化。
5. 代謝流量分析： 利用13C標記的葡萄糖和谷氨醯胺進行代謝流量追蹤，分析細胞代謝通路的變化。
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資料解讀
圖1：eIF2B活性降低誘導s-ISR
Figure 1 探討了eIF2B活性降低對s-ISR（選擇性整合應激反應）的影響。 A. 為了研究eIF2B活性降低對細胞的影響，作者透過使用特定抑制劑處理細胞，檢測eIF2B活性變化。結果顯示，抑制劑處理導致eIF2B活性顯著降低。 B. 透過免疫印跡分析，作者檢測了eIF2B活性降低對s-ISR標誌物的影響。結果表明，eIF2B活性降低後，s-ISR標誌物的表達水平顯著上升。 C. 為了進一步驗證eIF2B活性降低對s-ISR的影響，作者使用熒光顯微鏡觀察細胞內s-ISR相關蛋白的定位變化。結果顯示，eIF2B活性降低導致s-ISR相關蛋白在細胞內的重新分佈。 結論：eIF2B活性降低能夠誘導s-ISR的發生，表明eIF2B在細胞應激反應中的重要調控作用。
圖2：s-ISR受到eIF4E的正向調控
Figure 2 A. 為了探究eIF4E對s-ISR的調控作用，作者透過免疫印跡分析了eIF4E在不同處理條件下的表達水平。結果顯示，eIF4E的表達水平在特定處理條件下顯著上升，提示eIF4E可能參與s-ISR的調控。 B. 透過免疫熒光實驗，作者進一步驗證了eIF4E在細胞內的定位及其與s-ISR相關的作用。結果表明，eIF4E在細胞內的分佈與s-ISR的活性變化具有相關性，進一步支援了eIF4E對s-ISR的正向調控作用。 結論：實驗結果表明，eIF4E在s-ISR的調控中起到正向作用，提示eIF4E可能是s-ISR調控網路中的一個重要因子。
圖3：與VWM相關的EIF2B5突變誘導s-ISR
Figure 3 研究了與白質腦病（VWM）相關的EIF2B5基因突變對細胞應激反應（s-ISR）的影響。 A. 為了研究EIF2B5突變對s-ISR的影響，作者在細胞中引入了EIF2B5突變，並透過免疫印跡分析檢測了s-ISR相關蛋白的表達水平。結果顯示，EIF2B5突變顯著增加了s-ISR相關蛋白的表達。 B. 作者進一步透過免疫熒光實驗觀察了EIF2B5突變對s-ISR的影響。結果顯示，EIF2B5突變導致s-ISR相關蛋白在細胞中的定位發生了顯著變化。 C. 為了驗證EIF2B5突變對s-ISR的影響，作者進行了定量PCR分析，檢測了s-ISR相關基因的表達水平。結果表明，EIF2B5突變顯著上調了這些基因的表達。 結論：與VWM相關的EIF2B5突變能夠誘導細胞應激反應（s-ISR），並影響相關蛋白的表達和定位。
圖4：Atf4 uORF1是s-ISR所必需的
Figure 4 探討了Atf4的上游開放閱讀框1（uORF1）在選擇性整合應激反應（s-ISR）中的作用。 A. 為了研究Atf4 uORF1在s-ISR中的作用，作者對野生型和uORF1缺失的細胞進行了實驗處理，透過分析蛋白質表達水平，結果顯示uORF1缺失導致Atf4蛋白表達顯著下降。 B. 透過免疫印跡分析，作者檢測了不同應激條件下Atf4蛋白的表達，結果表明，在uORF1缺失的細胞中，Atf4蛋白表達顯著降低，表明uORF1在應激條件下對Atf4的翻譯至關重要。 結論：Atf4的uORF1對於s-ISR的正常功能是必需的，缺失uORF1會導致Atf4蛋白表達的顯著下降。
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主要結論
這篇文章揭示了一種新的應激響應機制，稱為分裂整合應激反應（s-ISR），它與傳統的整合應激反應（c-ISR）不同。s-ISR是在沒有eIF2α亞基磷酸化增加的情況下，由eIF2B活性降低觸發的。s-ISR依賴於eIF4E的翻譯，促進了ATF4 mRNA的穩定化，並引起一系列代謝基因的表達改變，以維持細胞能量穩態。這表明哺乳動物的ISR具有更大的可塑性。
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討論總結
文章挑戰了傳統觀點，即ISR是一種單一機制，無論應激的型別或持續時間，都是透過增加eIF2α的磷酸化和隨後的eIF2B活性降低來啟用的。研究表明，ISR的反應會根據eIF2α的磷酸化狀態和eIF2B的活性變化而不同。在沒有eIF2α磷酸化的情況下，eIF2B活性的降低會引發一種依賴於eIF4E的翻譯反應，與c-ISR相比，s-ISR在轉錄組和翻譯組的變化上是不同的。這種ISR的可塑性為細胞在應對不同強度的應激時提供了靈活性。此外，s-ISR在某些疾病，如白質營養不良症（VWMD）中扮演重要角色，而在該病中，eIF2B的改變會引發s-ISR，導致代謝適應。未來的研究需要更深入地揭示ISR在哺乳動物中的可塑性及其在應激適應和疾病中的作用。
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