01
研究背景
肌球蛋白作為分子馬達在真核生物中執行多種功能，從肌肉收縮到細胞器運輸，與多種疾病相關，如心臟病、耳聾和癌症。肌球蛋白的運動域由四個亞域組成，槓桿和輕鏈結合域形成了槓桿，放大了運動域內的變化。ATP的水解為肌球蛋白提供了能量，ATP結合後，肌球蛋白與F-肌動蛋白的親和力降低，導致複合物解離。隨後，肌球蛋白經歷恢復衝程，槓桿準備好產生力，ATP水解為ADP和無機磷酸鹽（Pi）。在沒有與肌動蛋白相互作用的情況下，Pi的釋放緩慢，限制了能量釋放的速率。結合F-肌動蛋白的肌球蛋白釋放Pi，導致裂隙閉合和運動的產生。肌動蛋白可以加速Pi的釋放，達1000倍。Pi釋放、裂隙閉合和動力衝程的順序一直存在爭議。透過這項研究，科學家們首次捕捉到了肌球蛋白在動力衝程中的結構變化，直接展示了擺動槓桿機制。
這篇論文透過時間分辨冷凍電子顯微鏡（cryo-EM）技術，首次直接展示了肌球蛋白的擺動槓桿機制。肌球蛋白是一種分子馬達，透過與F-肌動蛋白的相互作用在細胞中產生力和運動。研究人員使用了一種肌球蛋白-5突變體，這種突變體具有較慢的水解產物釋放特性，使得他們能夠捕捉到肌球蛋白在與F-肌動蛋白結合後的初始狀態（預動力衝程狀態）和後動力衝程狀態。研究發現，肌球蛋白透過其50 kDa下亞基與肌動蛋白結合，開放的肌動蛋白結合裂隙和抑制的磷酸鹽釋放是這一過程的關鍵。肌動蛋白與肌球蛋白的氨基末端相互作用促進了50 kDa上亞基的旋轉，導致裂隙閉合和磷酸鹽釋放，從而形成了有效力產生所需的強結合介面。研究還揭示了肌球蛋白槓桿的擺動角度為93°，主要沿著肌動蛋白軸線進行，幾乎沒有扭曲。這一研究解開了長期以來關於肌球蛋白如何產生運動的爭論。
02
研究發現
這篇論文透過時間分辨冷凍電子顯微鏡（cryo-EM）技術，首次直接展示了肌球蛋白的擺動槓桿機制。研究團隊使用了一種肌球蛋白-5突變體，該突變體具有較慢的水解產物釋放特性，從而捕捉到了肌動蛋白-肌球蛋白複合物在初始的預動力衝程狀態（primed state）和後動力衝程狀態（post-powerstroke state）之間的結構變化。研究發現，肌球蛋白在與肌動蛋白結合後，經歷了一系列微小但關鍵的結構變化，這些變化促進了肌球蛋白的槓桿擺動，最終產生了力。具體而言，肌球蛋白的上50-kDa亞結構域與肌動蛋白的結合導致了肌動蛋白結合裂隙的閉合，並釋放了磷酸鹽，這一過程是肌球蛋白產生有效力的關鍵。
研究揭示了肌球蛋白的槓桿擺動機制的結構特徵。透過時間分辨的cryo-EM資料，研究人員觀察到在與肌動蛋白結合後的10毫秒內，62%的肌動蛋白-肌球蛋白複合物處於預動力衝程狀態，而在120毫秒時，這一比例減少到36%，同時後動力衝程狀態的複合物比例增加。這一時間依賴的構象變化直接證明了肌球蛋白的槓桿擺動機制。此外，研究還發現，肌球蛋白的槓桿在肌動蛋白軸上擺動了約93°，這一擺動幅度與肌球蛋白-5沿肌動蛋白的典型步長相匹配。這些結構變化不僅揭示了動力衝程的結構過渡，還解決了長期以來關於肌球蛋白如何產生運動的猜測。
03
臨床意義
從臨床角度來看，肌球蛋白在許多生物過程中扮演重要角色，包括肌肉收縮和細胞內器官運輸，且與多種疾病（如心臟病、耳聾和癌症）有關。理解肌球蛋白的槓桿擺動機制，特別是其在分子水平上的力生成過程，有助於闡明這些相關疾病的發病機制。此外，這項研究中獲得的肌動-肌球蛋白複合體的詳細結構資訊也為設計針對肌球蛋白相關病症的藥物提供了新的思路和方向。
04
實驗策略
1. 樣品製備： 製備G-肌動蛋白並將其聚合為F-肌動蛋白。 通過杆狀病毒表達系統表達和純化攜帶突變的肌球蛋白-5頭段。
2. 時間分辨實驗： 使用自定義裝置進行快速混合，首先將肌球蛋白與ATP混合，然後與F-肌動蛋白混合。 在不同時間點將混合物噴灑到電子顯微鏡網格上，並進行冷凍，以捕獲10毫秒和120毫秒時的狀態。
3. 冷凍電鏡資料收集與處理： 使用Titan Krios顯微鏡收集資料，並透過RELION軟體進行處理。 使用三維分類和聚焦三維分類，區分出預備狀態和功率衝程後狀態的肌動肌球蛋白複合物。
4. 模型構建與分析： 使用Modeller軟體基於已有的高解析度結構生成同源偽原子模型。 使用分子動力學模擬精煉模型，探索肌動蛋白和肌球蛋白之間的介面相互作用。
05
資料解讀
圖1：活化的肌動蛋白-肌球蛋白-5複合物的結構
Figure 1 展示了活化的肌動蛋白-肌球蛋白-5複合物的結構，利用冷凍電子顯微鏡（Cryo-EM）技術進行分析。 a-b. 透過冷凍電子顯微鏡密度圖分析，展示了活化的肌動蛋白-肌球蛋白-5複合物的結構。圖中根據肌球蛋白的亞結構域和肌動蛋白鏈進行分段和著色，展示了中心的三個肌動蛋白亞基。肌動蛋白亞基分別用不同的灰色表示：靠近絲狀體指向端（−）的肌動蛋白為板岩灰色，靠近有棘端（+）的肌動蛋白為藍灰色，其他為淺灰色。核苷酸顯示為天藍色。密度圖的閾值設定為顯示次級結構（肌球蛋白為0.085，肌動蛋白為0.2），分別展示了肌動蛋白絲的側檢視（a）和指向端的端檢視（b）。 c. 展示了一個擬原子模型的骨架圖，該模型被擬合到電子顯微鏡密度圖中，檢視與b相同。 d. 放大顯示了肌動蛋白-肌球蛋白介面，主要接觸由肌球蛋白的螺旋-螺旋-環（HLH）結構和環3形成，這些接觸在強結合狀態下觀察到。 e. 環2形成了額外的接觸（電子顯微鏡密度閾值為0.007）。 f. 槓桿螺旋沿著肌動蛋白軸指向指向端，形成約52°的角度。 g. 放大顯示了−肌動蛋白亞基（板岩灰色）的N端殘基（D1和E2），與L50結構域的螺旋W（H637和N641）和環2（H631）相互作用（電子顯微鏡密度閾值為0.007）。 結論：透過冷凍電子顯微鏡分析，揭示了活化的肌動蛋白-肌球蛋白-5複合物的詳細結構特徵，展示了肌球蛋白與肌動蛋白的關鍵接觸區域及其空間構型。
圖2：啟用的肌動蛋白-肌球蛋白複合物與未結合的啟用肌球蛋白的結構比較
Figure 2 旨在比較啟用的肌動蛋白-肌球蛋白複合物與未結合的啟用肌球蛋白的結構差異，以揭示肌球蛋白結合肌動蛋白後的結構變化。 a. 為了比較啟用的肌動蛋白-肌球蛋白複合物與未結合的啟用肌球蛋白的結構，作者將兩者的核心介面（HLH結構域，殘基505-530）對齊，並進行疊加。結果顯示，觀察方向為指向肌動蛋白的尖端。 b. 透過計算肌球蛋白殘基在啟用的肌動蛋白-肌球蛋白複合物與未結合的啟用肌球蛋白之間的均方根偏差（r.m.s.d.），發現最大的結構移動發生在螺旋D。 c. 整個U50結構圍繞肌動蛋白軸向後傾，朝向轉換域，導致HCM環和環4遠離肌動蛋白表面。 d-e. 分別展示了未結合的啟用肌球蛋白（d）和啟用的肌動蛋白-肌球蛋白複合物（e）模型，聚焦於螺旋D、Y119、Y175和核苷酸，並與各自的冷凍電鏡影像疊加，閾值相同。 f. 疊加d和e的結果顯示，肌球蛋白與肌動蛋白結合後，螺旋D的移動導致酪氨酸殘基Y119和Y175的重新排列，從而在核苷酸結合口袋中給予ADP更大的放置自由度。Pi透過與P環（S165）、螺旋F（K169）和開關1（N214和S218）的相互作用固定。整個圖中展示了經過RELION後處理的啟用的肌動蛋白-肌球蛋白複合物圖。 結論：啟用的肌動蛋白-肌球蛋白複合物與未結合的啟用肌球蛋白的結構比較揭示了肌球蛋白結合肌動蛋白後，螺旋D的移動和酪氨酸殘基的重新排列，從而影響核苷酸結合口袋的結構。
圖3：動力衝程期間的結構變化
Figure 3 展示了在動力衝程過程中，肌動蛋白-肌球蛋白複合物的結構變化。 a,b. 為了展示動力衝程前後肌動蛋白-肌球蛋白複合物的結構變化，作者對比了動力衝程前（a）和動力衝程後（b）的肌動蛋白-肌球蛋白複合物結構，黑色箭頭指示了槓桿臂的位置。結果顯示，槓桿臂在這兩個結構之間擺動了約93°。 c,d. 在端檢視中，作者觀察到動力衝程前的肌動蛋白-肌球蛋白複合物具有開放的肌動蛋白結合裂隙（c），而動力衝程後的複合物則具有閉合的裂隙（d）。 e. 在頂檢視中，作者用矢量表示了動力衝程前後肌球蛋白殘基Cα原子的運動。結果顯示，最大的運動歸因於槓桿臂的擺動、U50的旋轉、與肌動蛋白的結合以及N端結構域的移動。 f,g. 作者展示了動力衝程前（f）和動力衝程後（g）HCM環和環4與肌動蛋白表面的相互作用。在動力衝程前，這些環遠離肌動蛋白表面，而在動力衝程後，它們與肌動蛋白髮生了相互作用。電子顯微鏡密度圖按肌球蛋白亞結構域分段並著色（等高線水平為0.008）。 h,i. 作者比較了動力衝程前（h）和動力衝程後（i）N端肌動蛋白與環2和螺旋W的相互作用。結果顯示，這些相互作用在動力衝程前後發生了變化。 j,k. 作者分析了動力衝程前（j）和動力衝程後（k）的核苷酸結合位點。電子顯微鏡密度圖按肌球蛋白亞結構域分段並著色（動力衝程前等高線水平為0.0085；動力衝程後為0.18）。結果顯示，透過U50的旋轉以及開關1和P環遠離開關2的移動，後門（R219和E442之間的鹽橋）被開啟。 結論：動力衝程期間，肌動蛋白-肌球蛋白複合物經歷了顯著的結構變化，包括槓桿臂的擺動、結合裂隙的閉合以及關鍵結構域和位點的重新排列。
圖4：肌球蛋白在F-肌動蛋白上的力生成和ATP酶啟用模型
Figure 4 展示了肌球蛋白在F-肌動蛋白上的力生成和ATP酶啟用的模型，分別從力生成和ATP酶啟用兩個方面進行詳細分析。 A. 為了展示肌球蛋白的初始結合狀態，作者描述了肌球蛋白的初始結合是透過肌球蛋白的環2與肌動蛋白亞基1的靜電相互作用實現的。這使得肌球蛋白的L50靠近肌動蛋白表面，從而形成立體特異性的初始肌動蛋白-肌球蛋白狀態。 B. 為了展示HLH結合對肌球蛋白的影響，作者指出肌動蛋白N端殘基1-2與螺旋W和環2相互作用，導致U50向轉換域迴旋，並圍繞F-肌動蛋白軸旋轉。 C. 為了展示肌動蛋白N端相互作用的重排，作者指出N端與螺旋W和環2的相互作用重排，導致環2在其C端穩定。這縮短了環2，旋轉U50，並吸引帶負電的支柱到帶正電的環2，促進裂縫閉合。 D. 為了展示裂縫閉合的結果，作者指出裂縫閉合導致需要維持力的強結合介面，並同時導致換能器的扭曲、中繼螺旋的拉直和槓桿的擺動。 E. 為了展示未結合的初始狀態，作者指出在未結合的初始狀態下，後門關閉，禁止磷酸根（Pi）釋放。 F. 為了展示結合後的變化，作者指出在肌球蛋白結合到肌動蛋白後，U50向轉換域迴旋，在核苷酸口袋中產生應變，ADP遠離協調良好的Pi，禁止水解逆轉並促進Pi釋放。 G. 為了展示U50旋轉的影響，作者指出隨著U50旋轉，U50與肌動蛋白表面的初始相互作用形成，開關1和P環相對於開關2發生位移，後門開啟，Pi被擠出到Pi釋放通道。 H. 為了展示後PS狀態，作者指出在後PS狀態下，Pi已被釋放，槓桿已擺動，後門開啟。Pi重新進入核苷酸口袋是非常不利的。 結論：肌球蛋白在F-肌動蛋白上的結合和力生成涉及一系列結構重排和相互作用的變化，這些變化促進了強結合介面的形成和ATP酶活性的啟用。
圖5：肌球蛋白-5在F-肌動蛋白上的工作衝程和行走
Figure 5 主要研究肌球蛋白-5在F-肌動蛋白上的工作衝程及其運動機制。 A. 為了觀察肌球蛋白-5的工作衝程，作者將準備態和後PS態的肌動蛋白肌球蛋白結構進行疊加，分別用深藍色和青色標記，並從側面觀察肌動蛋白。結果顯示，工作衝程約為34奈米，同時觀察到槓桿臂的輕微旋轉。 B-C. 從肌動蛋白絲的末端視角（B）和頂部視角（C）觀察，結果顯示槓桿臂末端的方位角位移非常小，僅為7°。 D-F. 當一個後PS態的肌球蛋白和一個準備態的肌球蛋白相距13個肌動蛋白亞基時，從側面（D）、末端（E）和頂部（F）觀察肌動蛋白絲，結果顯示兩個槓桿臂末端非常接近。 結論：肌球蛋白-5在F-肌動蛋白上的工作衝程約為34奈米，槓桿臂的旋轉和位移較小，表明其在肌動蛋白絲上的運動具有精確的控制。
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主要結論
預衝程狀態的捕捉：透過時間分辨冷凍電子顯微鏡（cryo-EM），研究者捕捉到了一種緩慢水解產物釋放的肌球蛋白-5突變體的預衝程狀態。研究顯示，10毫秒後，預衝程肌動蛋白-肌球蛋白複合物占主導地位，而在120毫秒時，後衝程複合物成為主要狀態。這表明肌球蛋白的槓桿擺動機制在分子水平上得到了直接證實。 結構變化的揭示：預衝程肌動蛋白-肌球蛋白複合物的結構顯示，肌球蛋白透過其下50 kDa亞域與肌動蛋白結合，結合裂縫處於開放狀態，且磷酸鹽釋放受到抑制。當肌動蛋白的氨基端與肌球蛋白相互作用時，上50 kDa亞域旋轉，關閉了結合裂縫並允許磷酸鹽釋放。這種相互作用為肌球蛋白的力產生提供了強結合介面。 槓桿擺動的量化：肌球蛋白-5的槓桿主要沿肌動蛋白軸擺動93°，幾乎沒有扭轉。這一擺動幅度與肌球蛋白-5沿肌動蛋白的典型步長相匹配，揭示了肌球蛋白如何透過槓桿擺動機制產生運動。
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討論總結
研究透過對時間分辨冷凍電鏡資料的分析，揭示了肌球蛋白從預衝程狀態到後衝程狀態的結構過渡。這一發現不僅直接證實了肌球蛋白的槓桿擺動機制，還為肌動蛋白催化ATP水解產物釋放的機制提供了新的見解。關鍵在於，肌球蛋白的預衝程結構與肌動蛋白的結合導致結構張力的產生，從而加速了磷酸鹽的釋放。這一機制在所有肌球蛋白類別中可能是保守的，對於理解肌球蛋白相關疾病的分子機制具有重要意義。 透過這一研究，科學家們不僅解開了肌球蛋白運動機制的長期爭議，還為未來的生物醫學研究提供了重要的結構基礎。這一進展對於理解肌球蛋白在肌肉收縮、細胞運動和分子運輸中的功能具有深遠的影響。
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