01
研究背景
三維（3D）生物列印技術在醫學領域中展現了巨大的變革潛力，能夠為患者量身定製植入物、複雜的醫療裝置和組織替代物。然而，這些構造的植入通常需要侵入性手術，限制了其在微創治療中的應用。儘管近紅外（NIR）光作為一種生物安全的能量源被用於體內列印，但其應用僅限於皮下組織，因為光的穿透深度有限。超聲技術以其深層組織穿透能力和非侵入性特點，為體內列印提供了一個有前景的平臺。其即時成像能力使得在原位生物材料製造過程中能夠實現精確的定位和控制。
在體內列印技術中，主要挑戰在於開發能夠適應多種生物材料的多功能生物墨水配方，以確保在各種醫療場景中的廣泛適用性，同時保證高生物相容性和最小的殘留預聚物毒性。為了解決這些問題，全面的體外和體內研究是必不可少的。此外，推進這些技術需要能夠進行大規模和高解析度列印的系統，並與即時成像無縫整合，以確保精確的焦點定位，最小化非目標組織的影響，並加速臨床轉化。研究團隊開發了一種成像引導的深層組織體內聲列印（DISP）平臺，該平臺利用低溫敏感脂質體（LTSLs）作為載體，攜帶交聯劑，以實現深層組織內生物材料的精確和可控的原位製造。
02
研究發現
這篇論文開發了一種名為DISP（深組織體內聲波列印）的平臺，該平臺利用成像引導的超聲波列印技術，實現了在體內深層組織中精確製造生物結構。研究團隊透過將低溫敏感脂質體（LTSLs）作為載體，攜帶交聯劑並將其整合到生物墨水中，利用聚焦超聲（FUS）實現了多種功能性生物材料的快速、按需交聯。DISP平臺的一個顯著優勢是其能夠在活體動物中進行即時監測和定製化圖案建立，成功地在小鼠膀胱和兔子腿部肌肉中進行體內列印，展示了其在區域性藥物遞送和組織替代方面的潛力。
DISP平臺能夠實現高解析度（約150微米）和快速列印速度（最高可達40毫米每秒），併成功列印了包括導電、載藥、細胞負載和生物粘附性水凝膠在內的多種功能性生物材料。透過整合氣泡囊（GV）為基礎的超聲成像，DISP平臺能夠在列印過程中進行即時監控，確保精確的焦點定位和體內交聯的驗證。研究還表明，DISP技術在活體動物中的應用具有高生物相容性，且其列印的水凝膠結構在組織中表現出良好的穩定性和功能性。這一技術的成功應用展示了其在生物電子學、藥物遞送、組織再生和傷口密封等多種生物醫學應用中的廣泛潛力。
03
臨床意義
微創植入和治療：DISP技術可以在無需手術的情況下，直接在體內特定部位列印生物結構。這對於需要快速修復和替換組織的情況下尤為重要，例如組織再生、藥物遞送和傷口密封。 多功能生物材料應用：研究展示了DISP技術能夠列印導電、載藥、載細胞以及具有生物粘附性的水凝膠材料。這種多功能性為個性化醫療應用提供了廣闊的可能性，包括製備生物電子裝置、區域性藥物輸送系統以及組織再生平臺。 即時成像與精確控制：DISP集成了氣泡囊基的超聲成像技術，允許即時監控列印過程，確保列印的精確性和高解析度。這為臨床應用中的精準性提供了保障，減少了對健康組織的潛在損害。 生物相容性與安全性：研究的體內實驗表明，使用該技術列印的水凝膠在生物相容性上表現良好，並且沒有顯著的毒性反應。這為其臨床應用的安全性提供了有力的支援。 潛在應用領域：研究成功展示了在小鼠膀胱和兔子腿部肌肉中進行體內列印的能力，顯示出該技術在治療性干預和組織替換方面的巨大潛力。 總體而言，DISP技術為微創醫學治療中的生物列印開闢了新的領域，具有顯著的臨床應用潛力，尤其是在需要精準、快速和安全的組織修復與替換的醫療場景中。
04
實驗策略
1. 生物墨水的設計與使用： 使用低溫敏感脂質體（LTSLs）作為交聯劑的載體，這些LTSLs在溫度略高於體溫時被啟用，釋放交聯劑。 生物墨水（US-ink）由生物聚合物、交聯劑-封裝的LTSLs和氣泡囊（GVs）組成，後者作為超聲成像的對比劑。
2. 聲波聚焦技術的應用： 使用聚焦超聲波（FUS）技術，透過自動定位系統將FUS聚焦點精確定位在US-ink上。 FUS引發區域性加熱，導致LTSLs釋放交聯劑，實現US-ink的即時原位交聯。
3. 成像與監控： 整合的氣泡囊（GVs）基超聲成像技術提供即時監控，確保精確的列印過程。 透過超聲波的即時成像，精準地監控列印過程和交聯驗證。
4. 實驗驗證與應用： 在小鼠膀胱和兔子腿部肌肉中進行活體實驗，驗證DISP的實用性。 成功列印了導電、藥物負載、細胞負載和生物粘附性水凝膠，展示了DISP在生物電子學、藥物遞送和組織再生等多個生物醫學領域的潛力。
05
資料解讀
圖1：成像引導的體內深層組織聲波列印（DISP）
Figure 1 展示了DISP平臺如何透過超聲波墨水（US-ink）在體內非侵入性地構建精確的功能性生物結構。該系統結合了基於氣泡的超聲成像，以監測目標器官、檢測預聚物的存在並確保準確定位和成功的超聲凝膠形成。 A. DISP平臺的示意圖。DISP系統使用一種由未交聯預聚物、載有交聯劑的溫敏脂質體（LTSLs）和氣泡組成的超聲波墨水。超聲波墨水被注射到體內，用於非侵入性地構建精確的功能性生物結構。整合的基於氣泡的超聲成像用於監測目標器官，檢測預聚物的存在，並確保準確定位和成功的超聲凝膠形成。 B. 用於聚焦超聲（FUS）生成和監測的體內列印設定。RF代表射頻，T/R代表發射器/接收器。 C. 載有交聯劑的溫敏脂質體（LTSLs）的透射電子顯微鏡（TEM）影像。比例尺為100奈米。 D. 凍乾的三維列印海藻酸鹽超聲凝膠的掃描電子顯微鏡（SEM）影像。比例尺為20微米。 E. 使用聲波進行體內列印的功能性水凝膠結構。比例尺為5毫米。 F-H. 基於DISP的體內列印用於感測和記錄的生物電子裝置（F），用於藥物遞送和組織再生的生物載體（G），以及用於傷口密封和裝置/組織介面的生物粘合劑（H）。 結論：DISP平臺能夠在體內非侵入性地構建多種功能性生物結構，包括生物電子裝置、生物載體和生物粘合劑，展示了其在醫學應用中的潛力。
圖2：低溫敏感脂質體的合成和表徵用於交聯劑的控制釋放
Figure 2 展示了低溫敏感脂質體（LTSLs）的合成及其在交聯劑釋放中的應用。 A. 透過示意圖展示了LTSLs在溫度輕微升高時，由固態向液態的相變過程，從而在脂質雙層中形成奈米孔的機制。 B. 透過擠出工藝實現了大規模生產負載交聯劑（如Ca2+）的LTSLs。 C. 透過動態光散射（DLS）分析了LTSLs在擠出前後的變化，結果顯示擠出後LTSLs的粒徑發生變化。 D. 使用熒光成像技術和fura-2-乙醯氧甲酯作為細胞內鈣指示劑，對Ca2+負載的LTSLs進行了成像，結果顯示了Ca2+的存在。 E. 穩定性研究顯示，在4°C和25°C儲存1個月和6個月後，LTSLs中Ca2+的釋放情況，結果表明溫度對Ca2+釋放的影響。 F. 透過紫外-可見光（UV-vis）分析，研究了LTSLs在43°C下不同時間的變化，結果顯示溫度對LTSLs的影響。 G. 研究了LTSLs在43°C和37°C下的溫度依賴性Ca2+釋放，結果表明在43°C時Ca2+釋放更顯著。 H. 研究了在固定LTSLs濃度為50 wt%時，不同加熱溫度下海藻酸鹽US-墨水的交聯時間，結果顯示溫度對交聯時間的影響。 I. 透過儲能模量（Gʹ）和損耗模量（Gʹʹ）評估了不同LTSL濃度下海藻酸鹽US-墨水的離子交聯，插圖展示了含有0%、15%和50% LTSLs的海藻酸鹽US-墨水在43°C暴露30秒後的凝膠狀態。 J. 測量了不同LTSL濃度下海藻酸鹽US-墨水的交聯時間，結果顯示LTSL濃度對交聯時間的影響。 K. 透過活/死染色成像觀察了人真皮成纖維細胞在海藻酸鹽、含50% LTSLs的海藻酸鹽US-墨水和海藻酸鹽US-凝膠中培養7天后的狀態，結果顯示細胞的存活情況。 結論：低溫敏感脂質體能夠在溫度變化時有效控制交聯劑的釋放，並且在生物材料的交聯過程中表現出良好的效能。
圖3：聚焦超聲誘導的3D列印特性
Figure 3 展示了聚焦超聲（FUS）在3D列印中的應用特性，包括其穿透深度、溫度分佈、壓力分佈以及列印解析度等方面的特性。 A. 透過示意圖展示了聚焦超聲波（FUS）波傳播的過程，說明了其對超聲墨水（US-ink）的精確定位能力。 B. 比較了超聲波與各種光源（如UVA、UVB和近紅外光）在組織中的穿透深度，結果顯示超聲波具有更優越的穿透能力，並指出超聲頻率與穿透深度之間的反比關係。 C. 透過熱模擬展示了在不同頻率和曝光時間下，焦點處的溫度分佈情況，尺度標尺為2毫米。 D. 展示了在8.75 MHz頻率下，聚焦超聲在10秒曝光期間及之後的焦點溫度變化曲線。 E-H. 使用2.65 MHz換能器在X-Z平面和X-Y平面進行的實驗測量和模擬結果，展示了焦點處的標準化壓力分佈圖。E和F為實驗測量結果，G和H為模擬結果。 I. 展示了DISP列印的超聲凝膠（US-gel）圖案，插圖的尺度標尺為400微米，右側圖案的尺度標尺為4毫米。 J. 使用8.75 MHz換能器在不同功率水平和列印速度下，評估了海藻酸鹽超聲墨水的可列印性。 K. 使用8.75 MHz換能器在不同功率水平和列印速度下，測量了海藻酸鹽超聲墨水的列印解析度，以線寬表示，尺度標尺為5毫米。 L. 在15毫米厚的豬腰肉組織下，以18 W功率、不同頻率和列印速度列印時，測量了海藻酸鹽超聲墨水的列印解析度，以線寬表示。插圖為豬肉組織上的深層列印圖案，尺度標尺為5毫米。 M. 使用DISP技術，透過5分鐘的0.025 M EDTA溶液處理，展示了在組織上圖案化的海藻酸鹽超聲凝膠的解離過程。圖中的誤差線表示平均值的標準偏差（n = 3）。 結論：聚焦超聲在3D列印中具有精確的定位能力、優越的組織穿透性、可控的溫度和壓力分佈，以及良好的列印解析度和可控的凝膠解離特性。
圖4：基於深層組織體內聲列印的功能性生物材料3D列印技術在多種醫學應用中的應用
Figure 4 A. 為了展示導電性US-ink的組成，作者提供了一個示意圖，顯示了碳奈米管（CNT）新增劑在海藻酸鹽US-ink中的纏繞，並透過聚焦超聲（FUS）進行交聯。 B. 透過測試導電性US-gel圖案在迴圈彎曲變形下的穩定性，發現其電學效能保持穩定。 C. 透過列印的導電性US-gel進行溫度感應測試，結果顯示在與人體皮膚接觸時，溫度感測器的響應是一致且可逆的。 D. DISP列印的導電性US-gel感測器用於人類參與者的心電圖（ECG）和肌電圖（EMG）記錄。 E. 將治療性生物分子整合到US-ink中，形成生物載體US-gel，展示了其作為藥物遞送應用的潛力。 F. 透過US-gel的模型藥物羅丹明B的持續和可持續釋放，展示了其藥物釋放能力。 G. 透過將細胞整合到生物相容性US-ink中，然後使用8.75 MHz的換能器以7 W和10 mm/min的列印速度進行列印，製備了細胞封裝的US-gel。 H. 透過活/死染色影像觀察到，列印後第1天和第3天，封裝在海藻酸鹽US-gel中的C2C12小鼠成肌細胞的存活情況。比例尺為100 μm。 I. 從列印後第1天到第7天，評估細胞的代謝活性。插圖顯示了使用8.75 MHz換能器以7 W和10 mm/min的列印速度列印的細胞負載US-gel圖案，3天后顯示活細胞。比例尺為200 μm。 J. 透過將兒茶酚修飾的明膠-咖啡酸共軛物（GelCA）US-ink與NaIO4脂質體混合，展示其在生物粘附應用中的潛力。 K. 測試了GelCA US-ink在交聯前後的粘附強度。插圖顯示了GelCA US-ink在輕微加熱和交聯前後的影像。 L. 在離體粘附測試中，GelCA US-gel用於封閉穿孔的心臟組織。比例尺為5 mm。 M. 在體內US誘導的粘附中，FUS促進了預聚物噴射到組織中，隨後透過原位交聯海藻酸鹽US-ink實現機械互鎖。 N. 在活體動物上，透過皮內注射US-ink並使用2.65 MHz換能器以7 W和20 mm/min的列印速度進行交聯，列印了海藻酸鹽US-gel。觀察到海藻酸鹽US-gel與組織之間的強介面粘附，使用藍色染料以提高可見性。比例尺為6 mm。 結論：圖4展示了基於聲列印的3D列印技術在生物材料的多種醫學應用中的潛力，包括導電性、藥物釋放、細胞封裝和生物粘附等功能。
圖5：成像引導的體內深層組織聲列印
Figure 5 展示了在活體動物中進行成像引導的深層組織聲列印技術及其實驗結果。 A. 為了在活體動物中進行聲列印，實驗採用超聲成像進行精確定位。插圖展示了一隻小鼠體內列印的線性圖案，比例尺為4毫米。 B-C. 使用AM模式超聲成像和GV對比劑監測體內US-ink的分佈，並確保精確定位。超聲影像插圖顯示了在橫截面中列印和成像的GV整合藻酸鹽US-ink線。未暴露於聚焦超聲（FUS）的GV保持完整，而暴露於FUS的GV則崩潰。 D. 在麻醉小鼠的膀胱腫瘤部位進行體內US-gels列印。透過GV崩潰確認成功定位。列印後，提取小鼠膀胱以驗證列印成功，比例尺為4毫米。 E. 使用整合到藻酸鹽US-inks中的GV Ca2+感測器進行原位Ca2+感應，設計用於在暴露於Ca2+時啟用。使用AM模式超聲成像列印並在橫截面中成像一條線。列印線中心的較高壓力導致部分GV Ca2+感測器崩潰，而列印US-gel邊界的GV Ca2+感測器被啟用，確認了形狀。 F. 在兔模型的腹部肌肉上使用2.65MHz FUS以11 W和15 mm/min的速度列印US-gel線，比例尺為5毫米。 G. 使用2.65 MHz FUS以20 W和10 mm/min的速度將US-gel線列印到內收肌深處和股二頭肌下方，比例尺為5毫米。 H. 透過蘇木精-伊紅染色（H&E）評估US-ink皮內注射和超聲列印US-gel在小鼠體內的生物相容性，分別在列印後1周和4周對皮膚組織進行評估，比例尺為200微米。 結論：實驗展示了成像引導的深層組織聲列印技術在活體動物中的應用，驗證了其在精確定位、列印形狀確認及生物相容性方面的有效性。
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主要結論
這篇由Davoodi等人發表在《Science》上的論文介紹了一種影像引導的深層組織體內聲波列印（DISP）平臺。該技術利用超聲波深入體內進行三維生物列印，解決傳統方法需要侵入性手術的問題。DISP透過將載有交聯劑的低溫敏感脂質體整合到生物墨水中，實現了精準、快速的交聯。這種方法在小鼠膀胱和兔子腿肌肉中進行了體內驗證，展示了其在區域性藥物遞送和組織替代方面的潛力。DISP能夠列印導電、藥物負載、細胞負載和生物粘合的生物材料，顯示出在不同生物醫學應用中的多功能性。
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討論總結
研究指出，DISP技術透過影像引導的超聲波實現了高精度和高解析度的生物結構深層體內列印。由於使用了眾多交聯化學物質，這項技術設計了各種生物墨水，包括導電、藥物負載、細胞負載和生物粘合的配方。即時超聲成像確保了在體內的精準目標定位和交聯控制。不僅體外研究顯示高生物相容性，體內研究也證實了預聚合物和列印的水凝膠的高生物相容性。作為概念驗證，該技術在小鼠膀胱和兔子腿肌肉中成功實現了體內列印，展示了其在精準治療干預和組織替代方面的潛力。這一創新為未來的精準醫療和組織工程開闢了新的可能性。
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