WB淪為最浪費實驗，原來問題出在實驗設計上

週五組會上，大家亂成一鍋粥。老闆因組裡實驗都卡在Western上發飆了！

我上週給大家發的綜述文獻都讀過了吧？難怪你們的專案都卡在WB實驗上，時間、經費都浪費了！

導師

師妹

居然是內參用錯了！難怪我的 WB 實驗結果總跳，還以為是人品問題

師弟

我的轉基因鼠！我的抗體！我的膠！因為我用錯了內參，讓你們死得好慘啊！

師姐

我還以為是實驗操作問題，讓師弟師妹們最佳化樣品、跑膠、轉膜、曝光，真的沒想到是內參的問題

組會亂成一鍋粥皆因一篇近期發表在Ageing Research Reviews的綜述文章。這篇題目為 Resolving the current controversy of use and reuse of housekeeping proteins in ageing research Focus on saving people’s tax dollars的文章揭露了一個鮮為人知的事實：實驗室最常規的 Western 實驗，竟因為內參的不當使用，而淪為經費的「吞金獸」。

圖源：文獻截圖

傳統觀念中，很多實驗人員認為管家蛋白（如 β-actin、GAPDH 和 Tubulin）在WB 實驗中的表達量穩定一致，所以常常將其用作內參，故千方百計地想把內參跑平。

然而，這篇綜述指出這些所謂“穩定”表達管家蛋白並非在所有條件下都穩定，不同的細胞型別、發育階段，以及衰老、壓力、藥物或刺激治療下管家蛋白的表達均會發生變化。如：

β-actin 的表達可能受到細胞應激的影響；

GAPDH 水平可能在糖酵解氧化應激/線粒體條件下變化。

這也意味著我們之前做過的大量 WB 實驗結果可能並不準確，為了獲得一張跑平的內參，以及符合預期的目的條帶，實驗人員不得不反覆實驗，既浪費了時間和精力，又耗費了課題組的實驗經費，使得 WB 淪為「實驗黑洞」。

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由於這些讓WB實驗變成黑洞的潛在可變性，驗證每個特定實驗條件下管家蛋白的穩定性至關重要。為了提高 Western 實驗的成功率和結果準確度，論文作者提出了 4 個解決方案，以此減少對單一管家蛋白的依賴，並減少重複實驗的時間以及費用成本：

正式實驗前，透過 WB 預實驗來評估管家蛋白表達的一致性；

採用其他定量技術，如定量 PCR 或質譜，來確定管家蛋白的 mRNA 或蛋白水平；

管家蛋白的分子量應與實驗目標蛋白的分子量有所區別，避免條帶重疊；

凝膠電泳的執行條件，包括是否使用梯度或固定濃度，需要提前考慮；

此外，該論文推薦了「總蛋白染色技術」以替代傳統內參，總蛋白染色適用於廣泛的樣本型別，消除了傳統內參蛋白表達量容易受影響的問題。這種染色方法不僅具有成本效益，易於使用，而且與不同樣本相容（包括管家蛋白表達不穩定的樣本）。同時，不用過多考慮電泳條件，不需要將傳統內參與目的蛋白進行分離，被推薦作為 Western Blot 實驗中的一種更優的內參方法。

Stain-Free 技術，正是一種總蛋白染色方法，Stain-Free 成像技術利用含有專有三鹵化合物的聚丙烯醯胺凝膠，透過短暫的光活化直接使凝膠中的蛋白質產生熒光，無需額外染色步驟即可在電泳和 WB 過程中立即視覺化蛋白質。它不依賴於單一的蛋白質內參，而是利用熒游標記來檢測凝膠或印跡膜上的總蛋白含量。

省時省錢：WB 結果雙保險

1、Stain-Free 技術：簡化實驗的熒游標記法

Stain-Free 技術的核心在於利用熒光染料對凝膠或印跡膜上的總蛋白進行標記，從而實現對樣品載入量的直接和定量評估。

這種方法的優勢在於其快速性和靈敏性，能夠在不依賴於特定蛋白質內參的情況下，提供一種全面的蛋白質上樣檢視。

2、Stain-Free 技術：省心省力的多重優勢

與傳統的總染色方法相比，Stain-Free 技術具有操作簡便、節省時間和成本的優勢。

操作簡便性：Stain-Free 技術避免了傳統染色的複雜步驟併兼容傳統WB實驗流程，使得實驗操作更加快捷和簡便。

時間和成本效率：無需額外染色，減少了實驗時間，同時降低了試劑使用成本，提高了實驗的經濟性。

結果準確性：Stain-Free 技術提供了總蛋白水平的均勻性驗證，確保了樣品載入量的一致性，從而提高了實驗結果的準確性和可靠性。

舉個例子，研究中傳統內參蛋白 Vinculin 的條帶在實驗中表現出不一致的變化，而 Stain-Free 技術所顯示的總蛋白水平則表明樣品載入量是均勻的。

圖片來源：參考文獻 2

依賴單一的 Vinculin 作為內參，研究者可能需要對樣品載入量進行調整，這不僅增加了實驗的操作複雜性，而且可能會引起目標蛋白表達量的不準確定量，進而影響實驗結論的可靠性。因此 Stain-Free 展示的總蛋白成為 WB 實驗的第二保險。

綜上，為了幫大家避免 WB 實驗內參不準帶來時間與經費上的浪費，我們特意準備了Stain-Free 免費申請試用！

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注：

1. 相關產品僅限科研使用，不作為臨床診斷。

2. Bio-Rad 是 Bio-Rad Laboratories, Inc. 在特定區域的商標。

3. 本活動的最終解釋權歸伯樂生命醫學產品（上海）有限公司。

參考文獻

[1]. Resolving the current controversy of use and reuse of housekeeping proteins in ageing research: Focus on saving people's tax dollars. Ageing Res Rev. 2024 Sep

[2]. Di Leo L, Pagliuca C, Kishk A, Rizza S, Tsiavou C, Pecorari C, Dahl C, Pacheco MP, Tholstrup R, Brewer JR, Berico P, Hernando E, Cecconi F, Ballotti R, Bertolotto C, Filomeni G, Gjerstorff MF, Sauter T, Lovat P, Guldberg P, De Zio D. AMBRA1 levels predict resistance to MAPK inhibitors in melanoma. Proc Natl Acad Sci U S A. 2024 Jun 18;121(25):e2400566121