01
研究背景
抗原交叉呈遞在樹突狀細胞的內質網中進行，是蛋白質疫苗誘導CD8 T細胞反應的關鍵步驟。然而，目前的研究主要集中在組織和細胞水平上的抗原遞送，亞細胞水平的遞送則較少涉及，尤其是從胞質到內質網的“最後一公里”遞送。現有的內質網靶向分子往往體積較大，親和力有限，限制了其臨床應用。為此，研究團隊開發了一種基於STING激動劑的內質網靶向分子（SABER），能夠有效將抗原遞送至內質網，並透過摺疊內質網膜形成微反應器，顯著增強CD8 T細胞對腫瘤新抗原和病毒表位的免疫反應。
樹突狀細胞是啟動CD8 T細胞反應的關鍵抗原呈遞細胞，透過主要組織相容性複合體I類（MHC-I）呈遞抗原並提供共刺激訊號。儘管在增強共刺激訊號方面取得了顯著進展，但改善抗原呈遞仍然是最佳化CD8 T細胞反應的關鍵。胞質途徑是交叉呈遞的主要途徑，涉及抗原遞送到胞質並隨後轉運至內質網。然而，內質網靶向的“最後一公里”仍未被充分探索。研究團隊透過篩選內質網外表面蛋白，發現STING蛋白是少數具有高親和力小分子激動劑的候選者之一。透過合成一系列化合物，研究團隊成功開發出SABER分子，能夠顯著增強抗原的交叉呈遞能力，並在體內外實驗中展示了其增強CD8 T細胞免疫反應的潛力。
02
研究發現
研究表明，SABER透過精確的亞細胞遞送，尤其是針對交叉呈遞的“最後一公里”遞送，能夠實現質的飛躍。SABER不僅增強了抗原在ER中的呈遞效率，還透過聚集關鍵的交叉呈遞機制形成微反應器，從而加速抗原肽的剪下和運輸。這一發現為高親和力ER靶向遞送系統和疫苗佐劑的開發提供了新的思路，表明透過精確的亞細胞遞送可以顯著提高疫苗的免疫效果。
SABER分子能夠有效地將抗原遞送到ER，並透過STING蛋白的聚集形成微反應器，顯著增強抗原的交叉呈遞能力。 SABER裝飾的抗原在體內外均表現出顯著增強的CD8 T細胞免疫反應，尤其是在腫瘤和病毒模型中，顯示出優於傳統佐劑的效果。 SABER的作用機制主要依賴於其ER靶向能力，透過STING的結合和ER膜的摺疊，形成了一個富集交叉呈遞關鍵機制的微反應器，從而提高了抗原的呈遞效率。 研究還發現，SABER不僅在增強細胞免疫方面表現出色，還能夠作為佐劑增強體液免疫，顯示出其在疫苗開發中的廣泛應用潛力。
03
臨床意義
提高T細胞應答的效率：SABER透過增強內質網上的抗原呈遞，提高了T細胞應答的效率。這種機制尤其在腫瘤免疫治療中顯示出潛在的臨床應用價值，因為增強的CD8 T細胞應答能夠更有效地識別和清除癌細胞。 提高疫苗的安全性和有效性：與傳統的抗原遞送方法相比，SABER展示了更高的遞送效率和更低的毒副作用，這對於疫苗的臨床應用具有重要意義。 促進新型疫苗的開發：透過SABER技術，研究者能夠開發出對快速進化的病原體（如SARS-CoV-2）的新型疫苗，這對於應對未來的傳染病挑戰具有重要的臨床價值。 綜上所述，SABER技術不僅為疫苗開發提供了一種全新的策略，還為增強免疫治療的臨床效果提供了有力的工具。
04
實驗策略
1. SABER的設計與合成： 研究人員首先尋找存在高親和力抑制劑或激動劑的內質網蛋白，最終選擇STING蛋白作為目標。 透過化學分析和晶體結構研究，選擇diABZI系列中的化合物2作為基礎，進行最佳化和修飾，合成了一系列SABER分子。 這些分子透過質譜和核磁共振進行驗證。
2. SABER的功能驗證： 使用骨髓來源的樹突狀細胞（BMDCs）進行體外實驗，評估SABER分子的STING啟用能力。 透過流式細胞術分析SABER裝飾的抗原在BMDCs中的交叉呈遞效率。
3. 體內實驗與免疫應答評估： 製備LNP（脂質奈米顆粒）封裝的SABER-抗原偶聯物，並在小鼠模型中進行免疫接種實驗。 使用OT-I細胞擴增實驗評估CD8 T細胞的免疫應答。 透過腫瘤模型驗證SABER在抗腫瘤免疫中的效果。
4. 機制研究： 使用免疫熒光和電子顯微鏡觀察SABER在細胞內的定位及其對內質網的靶向送遞。 研究SABER與STING結合後對抗原呈遞機制的影響，包括內質網相關的蛋白質聚集和微反應器的形成。
5. 對比與驗證： 將SABER與傳統的STING激動劑、其他佐劑（如poly-I:C、ODN1018）進行對比，證明其在增強CD8 T細胞免疫應答方面的優越性。
05
資料解讀
圖1：SABER修飾增強樹突狀細胞中的抗原交叉呈遞
Figure 1 旨在探討SABER家族化合物在樹突狀細胞（DCs）中對抗原交叉呈遞的影響。 a. 為了研究SABER家族化合物和diABZI的化學結構及其對IFNβ的影響，作者透過酶聯免疫吸附實驗（ELISA）測定了骨髓來源的樹突狀細胞（BMDCs）在24小時內的IFNβ水平，計算出EC50值。 b. 為了探討SABERs和diABZI對Ifnb1表達的影響，作者將野生型（WT）或STING缺失（STING−/−）小鼠的BMDCs與1 μM SABERs或diABZI共同孵育4小時，透過即時定量PCR（RT-qPCR）測定Ifnb1的表達。結果顯示，SABERs和diABZI均能誘導Ifnb1表達。 c. 為了分析ABM5–OVA或SR717–OVA對IFNβ的影響，作者將BMDCs與不同劑量的ABM5–OVA或SR717–OVA共同孵育24小時，測定IFNβ水平。結果表明，ABM5–OVA和SR717–OVA均能誘導IFNβ產生。 d. 為了驗證ABM5–OVA對Ifnb1表達的影響，作者將WT或STING−/− BMDCs與1 μM ABM5–OVA共同孵育4小時，透過RT-qPCR測定Ifnb1的表達。結果顯示，ABM5–OVA能誘導Ifnb1表達。 e. 為了研究不同處理對抗原呈遞的影響，作者將WT或STING−/− BMDCs與0.5 μM OVA250–264肽、diABZI與OVA肽的混合物（diABZI + OVA）或ABM5–OVA共同孵育8小時。 f-h. 為了分析抗原呈遞的具體指標，作者透過流式細胞術分析了H2-Kb(SIINFEKL)複合物（f）、CD86（g）和總H2-Kb（h）的表達。結果顯示，ABM5–OVA處理組在這些指標上表現出顯著的增強。 i-j. 為了動態監測交叉呈遞和CD86的變化，作者在BMDCs與0.5 μM diABZI + OVA或ABM5–OVA處理後2、4和8小時分別進行監測。結果顯示，ABM5–OVA處理組在交叉呈遞和CD86表達上表現出時間依賴性的增強。 k-l. 為了研究抗原呈遞對T細胞擴增的影響，作者將WT或STING−/− BMDCs與50 nM OVA肽、diABZI + OVA或ABM5–OVA共同孵育8小時，然後與CFSE標記的OT-I細胞共培養72小時，透過流式細胞術測定OT-I細胞的擴增。結果顯示，ABM5–OVA處理組的OT-I細胞擴增顯著增加。 m-n. 為了進一步驗證抗原呈遞對T細胞擴增的影響，作者在BMDCs接收50 nM OVA-i肽、diABZI + OVA-i或ABM5–OVA-i的情況下，類似地測定OT-I細胞的擴增。結果顯示，ABM5–OVA-i處理組的OT-I細胞擴增顯著增加。 結論：SABER修飾能夠顯著增強樹突狀細胞中的抗原交叉呈遞和T細胞擴增。
圖2：SABER介導的內質網靶向
Figure 2 研究了SABER技術在內質網靶向中的應用，重點分析了STING與OVA肽的共定位以及OVA肽在內質網和高爾基體中的分佈。 A-B. 為了研究STING與OVA肽的共定位，作者在STING缺失的HeLa細胞和表達STING-Flag的HeLa細胞中加入2.5 μM的Cy5.5標記的OVA250–264肽（OVA–Cy5.5）、diABZI + OVA–Cy5.5或ABM5–OVA–Cy5.5，孵育2小時後進行染色，並透過共聚焦顯微鏡進行分析。結果顯示，STING與OVA肽的共定位情況被計算並總結。 C-D. 為了進一步分析OVA肽在內質網和高爾基體的分佈，作者對細胞進行了與A相似的處理，並對內質網和高爾基體分別進行鈣網蛋白和GM130的染色。結果顯示，OVA肽與內質網和高爾基體的共定位情況被總結。 E-F. 為了研究OVA肽在內質網中的分佈，作者在表達STING-Flag的HeLa細胞中加入0.5 μM的OVA–biotin肽、diABZI + OVA–biotin、ABD–S–OVA–biotin或ABM5–OVA-biotin，孵育2小時後透過密度梯度超速離心法分離內質網。然後透過免疫點印法分析內質網分級中的OVA–biotin和鈣網蛋白。結果顯示，OVA–biotin和鈣網蛋白的相對密度被總結。 G-H. 為了測量H2-Kb(SIINFEKL)複合物和CD86的平均熒光強度（MFI），作者在骨髓來源的樹突狀細胞（BMDCs）中加入0.5 μM的ABD–S–OVA或ABM5–OVA。結果顯示，H2-Kb(SIINFEKL)複合物和CD86的MFI被測量。 I-J. 為了研究OT-I細胞的擴增情況，作者將BMDCs用50 nM的ABD–S–OVA或ABM5–OVA處理8小時，然後與OT-I細胞共培養72小時。結果顯示，擴增的OT-I細胞的總數和百分比被總結。 K. 為了分析交叉呈遞，作者將FLT3L培養的BMDCs用0.5 μM的OVA肽、ABD–S–OVA、diABZI + OVA或ABM5–OVA處理8小時，並在cDC1（CD11cB220+−CD24CD172α+−）和cDC2（CD11cB220+−CD24−CD172α）中進行分析。 結論：SABER技術能夠有效地介導OVA肽在內質網中的靶向，並影響其在細胞內的分佈和功能，尤其是在STING與OVA肽的共定位和交叉呈遞中發揮重要作用。
圖3：SABER修飾的抗原誘導強效的CD8 T細胞免疫反應
Figure 3 研究了SABER修飾的抗原在誘導CD8 T細胞免疫反應中的效果。 A. 為了研究不同處理對骨髓來源的樹突狀細胞（BMDCs）的影響，作者將BMDCs與100 nM OVA肽、diABZI + OVA或ABM5–OVA（無載體或包裹在脂質奈米顆粒（LNPs）中）孵育4小時。結果顯示，SABER修飾的抗原在BMDCs中具有顯著的免疫啟用效果。 B-C. 為了評估ABM5–OVA對OT-I細胞的影響，作者將BMDCs與50 nM OVA肽、ABM5–OVA或LNP包裹的ABM5–OVA孵育4小時，然後與OT-I細胞共培養72小時。結果表明，ABM5–OVA能夠有效促進OT-I細胞的活化。 D. 為了評估免疫反應，作者在第0天和第14天用diABZI + OVA或ABM5–OVA免疫小鼠，並在第21天分析外周血單個核細胞（PBMCs）中的OVA-四聚體CD8 T細胞。結果顯示，ABM5–OVA誘導了顯著的CD8 T細胞反應。 E. 為了研究STING在免疫反應中的作用，作者對野生型和STING−/−小鼠進行與D相同的免疫和分析。結果表明，STING缺失小鼠的免疫反應減弱。 F-G. 為了比較不同佐劑的效果，作者在第0天、第14天（F）和第28天（G）用ABM5–OVA或OVA肽（有無10 μg ODN1018、ISCOMs或poly-I:C）免疫小鼠。結果顯示，ABM5–OVA與佐劑結合能夠增強免疫反應。 H. 為了評估不同抗原的免疫效果，作者用ABM5–OVA、diABZI + OVA或ABD–S–OVA進行三次免疫。結果顯示，ABM5–OVA誘導了最強的免疫反應。 I. 為了研究Batf3在免疫反應中的作用，作者對野生型和Batf3−/−小鼠進行與D相同的免疫。結果顯示，Batf3缺失小鼠的免疫反應減弱。 J-K. 為了評估抗腫瘤效果，作者在第28天用2 × 10^5 B16-OVA挑戰小鼠。結果顯示，ABM5–OVA顯著抑制了腫瘤生長。 L-O. 為了評估對不同腫瘤模型的效果，作者用2 × 10^5 B16-OVA或5 × 10^5 E.G7-OVA接種小鼠，並在第4、11和18天給予diABZI + OVA或ABM5–OVA。結果顯示，ABM5–OVA在兩種腫瘤模型中均表現出顯著的抗腫瘤效果。 P. 為了評估對轉移性腫瘤的抑制效果，作者在第28天靜脈注射2 × 10^5 B16-OVA挑戰小鼠，並在第46天計數肺部轉移灶。結果顯示，ABM5–OVA顯著減少了轉移灶的數量。 結論：SABER修飾的抗原能夠有效誘導CD8 T細胞免疫反應，並在多種小鼠模型中表現出顯著的抗腫瘤效果。
圖4：SABER增強抗腫瘤和抗病毒免疫反應
Figure 4 探討了SABER（特定的免疫治療策略）在增強抗腫瘤和抗病毒免疫反應中的作用。 A. 為了評估SABER對CD8 T細胞的影響，作者對小鼠進行了ABM5–Adpgk或diABZI + Adpgk的三次給藥處理，並測量了Adpgk-tetramer CD8 T細胞的數量。結果顯示，接受SABER處理的小鼠中CD8 T細胞的數量顯著增加。 B-C. 為了研究SABER對腫瘤生長的影響，作者將小鼠接種1 × 10^5個MC38細胞，並在第4、11和18天給予10 nmol的ABM5–Adpgk或diABZI + Adpgk。結果表明，SABER處理組的小鼠腫瘤生長受到抑制，生存率提高。 D. 為了評估SABER的長期免疫記憶效應，作者在第90天對存活的小鼠進行重新挑戰。結果顯示，SABER處理組的小鼠對重新挑戰表現出更強的免疫反應。 E. 為了檢測SABER的長期免疫效應，作者在重新挑戰60天后分析了脾臟中的四聚體CD8 T細胞。結果顯示，SABER處理組的小鼠中CD8 T細胞的數量顯著增加。 F-G. 為了評估SABER在不同腫瘤模型中的效果，作者將小鼠接種1.5 × 10^5個B16F10細胞，並在第6、13和20天給予10 nmol的ABN2–M27、diABZI + M27和poly-I:C + M27，部分小鼠還接受了200 μg的抗PD1治療。結果顯示，SABER處理組的小鼠腫瘤生長受到顯著抑制。 H-I. 為了分析SABER對抗病毒免疫反應的影響，作者對小鼠給予30 nmol的ABM5–SNT或diABZI + SNT兩次，並透過ELISpot和細胞內細胞因子染色測量了經SNT再刺激的IFNγ表達細胞。結果顯示，SABER處理組的小鼠中IFNγ表達細胞的數量顯著增加。 J-K. 為了評估SABER在抗SARS-CoV-2中的效果，作者對hACE2-Tg小鼠進行類似免疫處理，並在第21天用SARS-CoV-2 BA.5.2進行挑戰，分析病毒載量。結果顯示，SABER處理組的小鼠病毒載量顯著降低。 L. 為了研究SABER對抗原特異性抗體產生的影響，作者在第0和14天給予小鼠100 μg的OVA蛋白單獨或與10 nmol的diABZI、ABM5–SNT、poly-I:C或ISCOMs聯合使用，並在第21天測量OVA特異性IgG。結果顯示，SABER處理組的小鼠中OVA特異性IgG的水平顯著提高。 M-N. 為了評估SABER對RBD-Fc抗體產生的影響，作者在第0和14天給予小鼠10 μg的RBD-Fc與10 nmol的diABZI + SNT或ABM–SNT，並在第14和21天測量WT RBD特異性IgGs。結果顯示，SABER處理組的小鼠中RBD特異性IgG的水平顯著增加。 結論：SABER能夠顯著增強抗腫瘤和抗病毒的免疫反應，提高CD8 T細胞的數量，抑制腫瘤生長，增強免疫記憶效應，並促進特異性抗體的產生。
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主要結論
這篇論文由中山大學、復旦大學和遼寧大學的聯合科研團隊發表，研究了基於STING激動劑的內質網（ER）靶向分子（SABER）在抗原交叉呈遞中的作用。研究發現，透過將抗原精確傳遞至內質網，SABER能夠顯著增強CD8 T細胞的免疫反應。這種方法在腫瘤新抗原和保守病毒表位的免疫應答中表現出色，遠超傳統佐劑的效果。SABER還保留了強效佐劑作用，顯著提高了SARS-CoV-2亞單位疫苗誘導廣泛中和抗體的能力。研究表明，SABER在抗原交叉呈遞的“最後一英里”中提供了高親和力的ER靶向傳遞系統和疫苗佐劑，展示了精準的亞細胞傳遞如何能帶來質的飛躍。
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討論總結
論文討論了現有的抗原傳遞策略主要集中在組織和細胞層面，而針對內質網的“最後一英里”傳遞仍然是未被充分探索的領域。SABER透過結合STING，能夠將抗原有效地靶向傳遞至內質網，形成交叉呈遞所需的微反應器，顯著加速抗原肽的切割和轉運，提升CD8 T細胞免疫應答。SABER不僅在腫瘤和病毒疫苗中表現出增強效果，還能在個性化腫瘤疫苗中發揮作用，展示了其在廣泛的疫苗開發中的潛力。研究結論強調，透過精確的亞細胞級傳遞和啟用共刺激訊號，SABER實現了比傳統佐劑更高效的免疫增強效果，為疫苗和免疫治療的研究和開發提供了新的方向。
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