本篇簡介Koeken的安裝和使用過程。
Koeken的安裝
首先安裝Koeken。
#使用 pip 安裝 Koeken
pip install https://github.com/twbattaglia/koeken/zipball/master
koeken.py –help
#或者編譯安裝
wget https://codeload.github.com/twbattaglia/koeken/zip/master
unzip master
cd koeken-master
python setup.py install
koeken.py –help
#或者 conda 安裝
conda install Koeken
koeken.py –help
檔案準備
Koeken的輸入檔案包括OTU丰度表和樣本分組檔案。
OTU錶轉化為biom格式，用過QIIME的同學應該對它不陌生；樣本分組資訊包含在mapping檔案裡，mapping檔案也是QIIME的標準配置檔案。
對於biom格式和mapping檔案的簡介可參考QIIME文件：
http://qiime.org/documentation/file_formats.html#mapping-file-overview
某試驗對微生物群落新增某種處理，分為對照組和處理組，並在處理後的第2、3、4天取樣，16S高通量測序獲得細菌群落資料。
#示例資料可獲取自 https://pan.baidu.com/s/1ctwyoTqT1ofygMUnTj7CPA
#otu_table.txt，OTU 丰度表
#otu_tax.txt，OTU 註釋檔案，資料庫隨意
#mapping.txt，QIIME 的 mapping 配置檔案，含樣本分組資訊
#常見的 OTU 丰度錶轉為 biom 格式，並新增 OTU 註釋資訊
cp otu_table.txt otu_table.tsv
sed -i '1i\# Constructed from biom file' otu_table.tsv
biom convert -i otu_table.tsv -o otu_table.biom –table-type="OTU table" –to-json
biom add-metadata -i otu_table.biom –observation-metadata-fp otu_tax.txt -o otu_table.tax.biom \
–sc-separated taxonomy –observation-header OTUID,taxonomy
執行Koeken
我們期望在每個時間點，比較處理和對照的細菌群落差異，從中找到最具代表性的差異類群。
然後以下是一個簡單示例，展示Koeken執行。分別代表時間和處理的變數，Day和Treatment，已經新增在mapping檔案中，分析時指定該列即可。
#執行 Koeken 的一個簡單示例，細節引數詳見 koeken.py –help
#例如，設定統計檢驗顯著性 p 值 0.05，LDA 得分值 2.0
koeken.py –input otu_table.tax.biom –map mapping.txt –output koeken_out \
–class Treatment –split Day –level 6 –pval 0.05 –effect 2 –clade –image pdf
結果目錄“koeken_out/lefse_output/run_lefse”裡面，即為本次分析結果。
同前文LEfSe分析，對於統計結果檔案，內容結構和LEfSe標準輸出一致。
對於每個時間點的比較分析，各自輸出一個統計結果檔案。這也是Koeken的一個優勢，允許一次同時並行分析多批次的資料，提高效率；同時各批次結果也能分開給出，便於我們各自比較。
第1列，每種微生物類群名稱；“Other”沒有自動去除，可手動過濾一下；
第2列，每種微生物類群在各分組類別中丰度平均值中最大值的log10（不過這不是原始丰度，而是標準化後的丰度，LEfSe自己有套標準化方法）；
第3列，若該微生物類群存在組間顯著差異，且線性判別得分（LDA score）高於設定閾值，則該列展示其所富集的分組類別名稱；若不存在顯著差異，則該列為空；
第4列，若該微生物類群存在組間顯著差異，且線性判別得分高於設定閾值，則該列展示其線性判別得分值，用以評估其對觀測到的組間差異的效應大小，該值越高代表該微生物類群越重要；若不存在顯著差異，則該列為空；
第5列，統計檢驗的p值，若顯著，則將這些微生物作為解釋類別之間差異的biomaker來看待；若不顯著，則該列值為“–”。
使用該結果進一步作圖，以圖形方式展示了由分層要素名稱指定的分類樹中發現的biomaker，見“koeken_out/lefse_output/run_lefse/cladograms”。
圖中每一個節點代表一種給定的微生物類群，對於不顯著的微生物使用黃色節點標註，顯著的則賦予其它顏色，顏色代表了其富集的分組，即表明這些分支在某些分組中具有更高的丰度。
不過由於上述結果表格沒有自動過濾一些不重要的類群（如Other等），所以作圖結果中的點很密集，很不好看。
此時不妨手動過濾一下上述結果表格，將其中的一部分不顯著的微生物類群去除，之後再將編輯後的表讀入LEfSe程式作圖。如前文LEfSe教程所述，可以使用Galaxy雲平臺，也可使用本地版的LEfSe，過濾不重要資料後表格的出圖效果應該會“整齊”很多。
