01
研究背景
Taxol（紫杉醇）是一種廣泛使用的抗癌藥物，其複雜的生物合成途徑長期以來令生物化學家困惑。由於化學合成效率低下，Taxol的供應主要依賴於昂貴的半合成方法。揭示Taxol的生物合成途徑不僅能解決生物化學領域的長期問題，還能透過生物技術方法實現成本效益高的生產。儘管最近的研究提高了我們對形成中間體baccatin III步驟的理解，但途徑的最後步驟仍不清楚。在這項研究中，研究人員透過基因共表達分析、化學合成中間體以及逐步的“邊建邊學”方法，揭示了催化最後兩種修飾（即C2′α羥基化和3′-N苯甲醯化）的酶，這些修飾對Taxol的生物活性至關重要。為了取代當前的半合成方法，研究人員在酵母中重建了後期途徑，並從易得的中間體baccatin III合成了Taxol。這項工作為Taxol生物合成提供了完整的理解，併為其生物技術生產奠定了基礎。
Taxol是最常用的化療藥物之一，對乳腺癌、卵巢癌、宮頸癌、鼻咽癌和非小細胞肺癌等多種癌症有效。它透過阻止微管的解聚來發揮抗有絲分裂活性。最初從成熟太平洋紫杉樹的內皮中分離出來，由於樹皮中含量極低，從紫杉樹中獲取Taxol並不可行。Taxol的化學合成由於其複雜的化學結構而效率低下。因此，製藥用Taxol目前要麼透過紫杉細胞培養生產，要麼透過從更易獲得的植物衍生紫杉烷進行半合成。這兩種方法都成本高昂，使得Taxol及其衍生物（多西他賽和卡巴他賽）成為價格最高的小分子活性藥物成分之一。為了改善Taxol的供應，生物技術生產是一種有前景的替代方案。然而，由於對生物合成途徑的瞭解不完整，進展受阻。
02
研究發現
Taxol生物合成途徑的最後步驟解析：研究團隊透過基因共表達分析、化學合成中間體和逐步的學習-構建方法，揭示了催化Taxol生物合成最後兩個關鍵修飾步驟的酶，即C2′α羥基化和3′-N苯甲醯化。這些步驟對於Taxol的生物活性至關重要。透過在酵母中重建晚期合成途徑，研究人員成功地從中間體baccatin III合成了Taxol。這一發現不僅解決了長期以來生物化學領域的一個難題，還為利用生物技術方法進行Taxol的成本效益生產奠定了基礎。
生物技術生產Taxol的潛力：研究進一步在酵母中重建了從baccatin III到Taxol的生物合成途徑，展示了利用微生物系統進行Taxol生產的可行性。透過引入苯甲醯輔酶A（CoA）合成模組，研究團隊提高了Taxol的產量。這種生物技術方法相比於傳統的半合成方法具有顯著的環境和經濟優勢，因為它減少了對石化產品的依賴，並且可以使用粗提取物作為起始材料，從而降低了生產成本。
03
臨床意義
降低生產成本：透過生物技術方法生產紫杉醇，有望降低生產成本，增加供應鏈的穩定性。傳統的化學半合成方法成本高昂且依賴於高純度的起始材料，而透過工程化微生物或植物宿主來生產紫杉醇，可以利用粗提取物，減少生產成本。 環境友好：生物技術生產減少了對石化產品、催化劑和溶劑的依賴，降低了環境影響。這種可持續生產方式可能比傳統方法更環保，對生態系統的影響較小。 推動癌症治療：紫杉醇作為一種關鍵的化療藥物，其更為經濟高效的生產方法可能提高其可及性，從而改善癌症治療的可用性和患者的治療效果。 研究基礎：本研究為紫杉醇生物合成路徑的完整理解鋪平了道路，併為其他複雜天然產物的生物技術生產提供了借鑑。透過進一步最佳化並提升生產效率，該方法有望應用於工業化生產。 總之，這項研究不僅在科學上解決了一個長期未解的生物化學問題，還為紫杉醇的更經濟和可持續的生產提供了實際路徑，具有重要的臨床和產業意義。
04
實驗策略
1. 基因共同表達分析：透過分析不同紫杉屬植物的基因組和轉錄組資料，研究團隊進行了基因共同表達分析，識別出與已知Taxol生物合成基因表達模式相似的候選酶基因。
2. 化學合成中間體：研究人員合成了多個關鍵的中間體化合物，以便在實驗中作為底物或標準品使用。這些化合物包括N-脫苯甲醯-2′-脫氧-紫杉醇等。
3. 功能驗證與路徑重建： 使用菸草（Nicotiana benthamiana）作為植物表達系統，透過瞬時表達法重建生物合成途徑。對候選酶進行功能驗證，以確認其在Taxol合成中的作用。 透過化學合成的中間體和功能驗證實驗確定了新的關鍵酶，包括T2′OGD（taxoid-2′-氧基穀氨酸依賴性雙加氧酶）和T3′NBT（taxoid-3′-N-苯甲醯基轉移酶）。
4. 酵母系統中的生物合成： 將識別出的酶引入釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），用於重建從baccatin III到Taxol的生物合成途徑。 透過蛋白質工程和代謝工程提高酵母細胞中酶的表達和中間體的轉化效率。
5. 苯甲醯輔酶A（benzoyl-CoA）生產模組： 為了提高Taxol的產量，研究人員在酵母中引入了一套從肉桂酸合成苯甲醯輔酶A的代謝模組，以增強苯甲醯輔酶A的供應。
05
資料解讀
圖1：紫杉醇生物合成的最後步驟
Figure 1 展示了紫杉醇生物合成的最後步驟，包括β-苯基丙醯輔酶A的合成路徑以及從10-去乙醯巴卡亭III到紫杉醇的生物合成路徑。 a. 為了展示β-苯基丙醯輔酶A的合成路徑，作者提供了該合成路徑的詳細步驟，顯示了涉及的化學反應和中間產物。 b. 為了揭示從10-去乙醯巴卡亭III到紫杉醇的生物合成路徑，作者展示了該路徑中涉及的酶。其中，新發現的酶（T2′OGD和T3′NBT）用藍色標出，而之前報道的酶用黑色標出。 結論：該圖詳細展示了紫杉醇生物合成的最後步驟，並標識了新發現的酶，豐富了對紫杉醇合成路徑的理解。
圖2：由taxoid-2′-氧戊二酸依賴性雙加氧酶催化的紫杉醇中間體N-去苯甲醯紫杉醇（3）從N-去苯甲醯-2′-脫氧紫杉醇（2）的生物合成
Figure 2 展示了在菸草中合成紫杉醇中間體N-去苯甲醯紫杉醇（3）的過程，重點研究了taxoid-2′-氧戊二酸依賴性雙加氧酶在此過程中的作用。 A. 為了在菸草中建立N-去苯甲醯-2′-脫氧紫杉醇（2）的生物合成，作者對菸草葉片的提取物進行了正離子提取離子色譜分析，顯示了baccatin III（1）和N-去苯甲醯-2′-脫氧紫杉醇（2）的水平。每個色譜圖中，綠色實心方塊表示瞬時產生的酶（PAM、BAPT和/或CoAL(A312G)），藍色實心方塊表示外源底物（200 mg l−1 β-苯丙氨酸和/或200 mg l−1 baccatin III）的供應。空方塊表示缺乏相應的酶或底物。PAM產生的β-苯丙氨酸足以驅動N-去苯甲醯-2′-脫氧紫杉醇（2）的高效生物合成，因為外源β-苯丙氨酸的供應並未增加N-去苯甲醯-2′-脫氧紫杉醇（2）的水平。 B. 在菸草中合成N-去苯甲醯紫杉醇（3）。正離子提取離子色譜分析顯示了baccatin III（1）、N-去苯甲醯-2′-脫氧紫杉醇（2）和N-去苯甲醯紫杉醇（3）的水平。先前被提議為羥基化2的CYP酶TB506無法合成3。新鑑定的T2′OGD在存在2時（由PAM、BAPT和CoAL(A312G)的協調作用提供或以50 mg l−1的濃度外源供應）可以高效合成3。 結論：研究表明，taxoid-2′-氧戊二酸依賴性雙加氧酶在菸草中能夠高效催化N-去苯甲醯紫杉醇（3）的生物合成，而CYP酶TB506則不能。
圖3：T3′NBT催化N-去苯甲醯紫杉醇（3）合成紫杉醇的生物合成
Figure 3 探討了T3′NBT在紫杉醇生物合成中的作用，特別是其在3′N-苯甲醯化反應中的催化能力。 a. 透過對瞬時表達PAM、BAPT、CoAL(A312G)、T2′OGD以及DBTNBT或T3′NBT的菸草葉片提取物進行正離子模式下的EICs分析，研究者觀察到低水平的紫杉醇（4，C47H52NO14+，m/z = 854.3382 ± 0.01）可以透過菸草內源酶將N-去苯甲醯紫杉醇（3，C40H48NO13+，m/z = 750.3120 ± 0.01）轉化而來。當DBTNBT存在時，紫杉醇水平不會超過背景值。只有在PAM、BAPT、CoAL(A312G)、T2′OGD和T3′NBT同時存在時，紫杉醇才會從N-去苯甲醯紫杉醇（3）合成並超過背景水平。實驗中瞬時產生的酶用實心綠色方塊表示。Baccatin III在侵染後2天以200 mg l−1的濃度供應。 b. 研究者測量了在表達PAM、BAPT、CoAL(A312G)和T2′OGD的菸草中，在沒有苯甲醯轉移酶（No BTase）、存在DBTNBT以及存在T3′NBT的情況下紫杉醇的水平。資料顯示為n = 3個獨立生物重複的平均值±標準差。單因素方差分析（ANOVA）P值（P = 0.000095）表明T3′NBT與其他兩個樣本之間存在統計學顯著差異。DBTNBT樣本與沒有苯甲醯轉移酶的樣本之間沒有統計學顯著差異（NS）。 結論：T3′NBT是紫杉醇生物合成中3′N-苯甲醯化反應的關鍵催化酶，能夠有效地將N-去苯甲醯紫杉醇轉化為紫杉醇，而DBTNBT則沒有這種催化能力。
圖4：10-去乙醯巴卡亭III作為晚期紫杉醇生物合成途徑的替代入口
Figure 4 展示了10-去乙醯巴卡亭III在紫杉醇生物合成途徑中的作用，特別是其在晚期合成階段的替代入口功能。 a. 為了研究10-去乙醯巴卡亭III（10-DAB）在紫杉醇生物合成中的作用，作者在瞬時表達PAM、BAPT、CoAL(A312G)、T2′OGD和T3′NBT的菸草葉片中，外源性提供10-DAB，分析了其轉化為10-去乙醯-N-去苯甲醯-2′-脫氧-紫杉醇（6）、10-去乙醯-N-去苯甲醯-紫杉醇（7）和10-去乙醯-紫杉醇（8）的過程。透過正離子模式的提取離子色譜（EICs）檢測，結果顯示10-DAB（5, C29H37O10+, m/z = 545.2381 ± 0.01）成功轉化為10-去乙醯-N-去苯甲醯-2′-脫氧-紫杉醇（6, C38H46NO11+, m/z = 692.3065 ± 0.01）、10-去乙醯-N-去苯甲醯-紫杉醇（7, C38H45NO12, m/z = 708.3015 ± 0.01）和10-去乙醯-紫杉醇（8, C45H50NO13+, m/z = 812.3277 ± 0.01）。 b. 透過研究DBAT酶的底物特異性，作者發現DBAT是一種具有廣泛底物特異性的酶，能夠接受10-去乙醯-N-去苯甲醯-2′-脫氧-紫杉醇（6）和10-去乙醯-N-去苯甲醯-紫杉醇（7）作為底物，分別生成N-去苯甲醯-2′-脫氧-紫杉醇（2）和N-去苯甲醯-紫杉醇（3）。透過正離子模式的提取離子色譜（EICs）檢測，結果顯示10-去乙醯-N-去苯甲醯-2′-脫氧-紫杉醇（6）和10-去乙醯-N-去苯甲醯-紫杉醇（7）成功轉化為N-去苯甲醯-2′-脫氧-紫杉醇（2）和N-去苯甲醯-紫杉醇（3）。 結論：10-去乙醯巴卡亭III可以作為晚期紫杉醇生物合成途徑的替代入口，透過DBAT酶的作用，進一步轉化為紫杉醇的衍生物。
圖5：在釀酒酵母中重建晚期紫杉醇生物合成途徑
Figure 5 為了在釀酒酵母中重建紫杉醇的晚期生物合成途徑，研究人員對相關酶進行了最佳化和表達，以提高目標產物的產量。 A. 為了最佳化BAPT酶以增加N-去苯甲醯-2'-脫氧-紫杉醇（2）的產量，研究人員在釀酒酵母中表達了不同的BAPT變體。所有三個菌株均從外源質粒表達CoAL(A312G)。其中，LT01菌株表達BAPT，LT02菌株表達BAPTm，LT03菌株表達與麥芽糖結合蛋白融合的BAPTm（MBPig3BAPTm）。實驗結果顯示，LT01中N-去苯甲醯-2'-脫氧-紫杉醇（2）的產量被設為基準1，其他菌株的產量相對於LT01進行了比較。資料以平均值±標準差表示，來自3個生物重複。單因素方差分析（ANOVA）P值表明這些菌株之間的產量差異具有統計學意義。 B. 在酵母中合成紫杉醇（4）。透過正離子模式的提取離子色譜（EICs），顯示了在補充100 mg/l baccatin III和100 mg/l β-苯丙氨酸的酵母培養物的乙酸乙酯提取物中，N-去苯甲醯-2'-脫氧-紫杉醇（2）、N-去苯甲醯-紫杉醇（3）和紫杉醇（4）的水平。實心橙色方塊表示所產生的蛋白質。 結論：透過在釀酒酵母中最佳化和表達特定的酶，成功重建了紫杉醇的晚期生物合成途徑，並實現了目標產物的有效合成。
圖6：從紫杉醇III在酵母中生物技術生產紫杉醇
Figure 6 為了實現紫杉醇的生物合成，研究人員在酵母菌株EGY48中引入了紫杉醇生物合成的最終步驟，並整合了一個五步的“苯甲醯輔酶A生產模組”，以促進紫杉醇的生產。該模組由A. thaliana的PAL、P. hybrida的CNL、CHD和KAT1酶組成。 A. 為了驗證紫杉醇的生物合成，作者在酵母菌株EGY48中引入了紫杉醇生物合成的最終步驟，並整合了一個五步的“苯甲醯輔酶A生產模組”，該模組由A. thaliana的PAL、P. hybrida的CNL、CHD和KAT1酶組成。實驗中，提供了100 mg l−1的β-苯丙氨酸和紫杉醇III作為底物。結果表明，經過這些改造的酵母菌能夠有效地生產紫杉醇。 結論：透過在酵母中引入紫杉醇生物合成的關鍵步驟和相關酶，成功實現了從紫杉醇III到紫杉醇的生物技術生產。
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主要結論
這篇論文揭示了Taxol（紫杉醇）生物合成的最後步驟，解決了長期以來困擾生物化學家的難題，併為其生物技術生產奠定了基礎。研究團隊透過基因共表達分析、化學合成中間體以及逐步的學習與構建方法，確定並驗證了催化關鍵C2′α羥基化和3′-N苯甲醯化步驟的酶。論文中確定了兩種新酶，分別是taxoid-2′-oxoglutarate-dependent dioxygenase（T2′OGD）和taxoid-3′-N-benzoyltransferase（T3′NBT），它們在菸草和酵母系統中表現出高效的活性，成功地將紫杉醇從簡單的中間體baccatin III合成出來。這一發現補全了紫杉醇的生物合成路徑，併為其在工程化的微生物或植物宿主中的大規模可持續生產提供了可能。
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討論總結
研究詳細總結了實驗過程中採用的系統性方法，這包括關鍵酶的功能驗證和缺失活性的識別，最終完成了紫杉醇生物合成路徑的最後步驟。研究表明，之前對紫杉醇生物合成路徑中最後兩步修飾（C2′α羥基化和3′-N苯甲醯化）的酶的錯誤歸屬已經得到糾正。透過跨三個不同的紫杉屬物種進行共表達分析，研究人員成功識別了T2′OGD和T3′NBT為正確的催化酶，並在菸草和酵母中驗證了其功能。基於此知識，研究團隊利用微生物系統開發了一種可持續且可擴充套件的紫杉醇生產方法，建立了從baccatin III到紫杉醇的酵母細胞工廠。儘管目前紫杉醇的生物轉化效率較低，但研究為工業規模的紫杉醇生產提供了一條可行的生物技術平臺，並指出了進一步最佳化的關鍵步驟和策略。
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